МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 3, с. 295-299
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 582.232+637.17
МИКОЦИН КЬиУУЕЮМУСЕЗ ЬАСШ, АКТИВНЫЙ ПРИ НЕЙТРАЛЬНОЙ РЕАКЦИИ рН
© 2013 г. В. И. Голубев
Всероссийская коллекция микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино
Поступила в редакцию 21.08.2012 г.
Обнаружен штамм Шыууеготусез \actis, секретирующий фунгицидный микоцин, действующий в диапазоне значений рН среды от 6 до 9 и наиболее активный при рН около 7. К микоцину чувствительны отдельные виды дрожжей семейств Басскаготусе1асеае и Ш1скегкатотусе1асеае. Ряд таксонов в этом отношении гетерогенен. Антифунгальная активность штамма элиминируется после облучения УФ. Хотя прокариоты к микоцину не чувствительны, найденный штамм подавляет рост отдельных бактерий.
Ключевые слова: дрожжи, микоцин, киллер-токсин, антибактериальная активность.
DOI: 10.7868/S0026365613030075
Дрожжи Kluyveromyces lactis (Dombrowski) van der Walt широко, уступая в лишь сахаромицетам, используют в фундаментальных, прикладных исследованиях и в пищевой промышленности. В частности, они применяются для коммерческого производства ß-галактозидазы, химозина, других гетерологичных белков, БВК и этанола из молочной сыворотки [1, 2].
30 лет назад обнаружено, что некоторые штаммы этого вида секретируют подавляющий рост других дрожжей гликопротеин (киллер-токсин, микоцин, зимоцин), синтез которого детерминирован линейными двунитевыми ДНК плазмида-ми [3]. Результаты большого с тех пор количества работ по изучению этого явления суммированы в нескольких обзорах [4, 5].
Активность известных микоциногенных штаммов K. lactis наиболее высока при пониженных значениях рН среды, и спектр действия их микоци-нов довольно широк [6]. В настоящей работе описан штамм, который наиболее активен при нейтральном значении рН среды, отличаясь также узким спектром действия.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы культуры Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) (http://www.vkm.ru). Большинство обследованных видов представлено их типовыми штаммами, а родов — типовыми видами. Штамм K. lactis ВКМ Y-1868 выделен М.Ф. Цыганковым в 1948 г. из ча-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: wig@ibpm.pushchino.ru).
ла, туркменского кисломолочного напитка из верблюжьего молока.
Тестирование чувствительности к микоцину штамма ВКМ Y-1868 проводили методом "культура против культуры" на указанной ниже агари-зованной среде, которая также использована для оценки устойчивости микоцина к повышенной температуре и протеазам (10 мг/мл) методом лунок в агаре. При наличии вокруг культуры штамм ВКМ Y-1868 зоны подавления роста в несколько мм тестируемые штаммы регистрировали как чувствительные, при отсутствии зоны — как нечувствительные. При образовании узкой зоны (около 1 мм) штаммы относили к слабо чувствительным. Мико-цин-содержащую культуральную жидкость получали, инкубируя микоциногенный штамм в глюко-зо-пептонной среде [6]. Для ориентировочной оценки молекулярной массы микоцина штамм ВКМ Y-1868 выращивали на среде для тестирования чувствительности, покрытой диализной мембраной ("Spectrum", США). После недели инкубации мембрану с выросшей на ней культурой удаляли и среду засевали газоном чувствительного к микоцину штамма Wickerhamomyces subpellic-ulosa BKM Y-1088. Для элиминации активности высевы культуры ВКМ Y-1868 от 3 до 5 мин облучали УФ (254 нм, -200 Дж/м2).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Антифунгальная активность штамма K. lactis ВКМ Y-1868 обнаруживается при значениях рН среды от 6.0 до 9.0 (цитрат-фосфатный буфер). Наибольшие зоны подавления роста чувствительных культур наблюдали при рН 7.0—7.5, они воз-
296
ГОЛУБЕВ
Таблица 1. Дрожжи, нечувствительные к микоцину Kluyveromyces 1асШ ВКМ У-1868 (количество обследованных видов, штаммов)
Aciculoconidium (1, 1) Komagataea (1, 1) Sakaguchia (1, 1)
Agaricostilbum (1, 1) Kondoa (1, 1) Saturnispora (1, 1)
Ambrosiozyma (1, 1) Kregervanrija (1, 1) Scheffersomyces (1, 1)
Babjeviella (1, 2) Kuraishia (1, 1) Schizoblastosporion (1, 1)
Barnettozyma (3, 10) Kurtzmanomyces (1, 1) Schwanniomyces (7, 9)*
Bensingtonia (1, 1) Kwoniella (1, 1) Sebacina (1, 1)
Blastobotrys (1, 2) Lachancea (2, 4) Sirobasidium (1, 1)
Bullera (1, 1) Leucosporidiella (1, 1) Sporidiobolus (1, 1)
Bulleromyces (1, 1) Leucosporidium (1, 1) Sporobolomyces (3, 3)
Candida (5, 5)* Lindnera (10, 12)* Sporopachydermia (1, 1)
Citeromyces (1, 1) Lipomyces (2, 2) Starmera (4, 7)
Clavispora (1, 2) Lodderomyces (1, 1) Sterigmatomyces (1, 1)
Cryptococcus (1, 1) Magnusiomyces (1, 1) Sugiyamaella (1, 1)
Cuniculitrema (1, 1) Mastigobasidium (1, 1) Sympodiomycopsis (1, 1)
Curvibasidium (1, 1) Metschnikowia (9, 11) Tausonia (2, 2)
Cystofilobasidium (1, 1) Meyerozyma (1, 1) Tetrapisispora (2, 2)
Debaryomyces (1, 1) Millerozyma (1, 1) Tilletiopsis (1, 1)
Dekkera (3, 5) Mrakia (1, 1) Torulaspora (4, 4)
Dioszegia (1, 1) Mrakiella (1, 1) Tremella (1, 1)
Dipodascopsis (1, 1) Myxozyma (2, 2) Trichomonoascus (1, 1)
Eremothecium (1, 1) Nadsonia (2, 7) Trichosporon (1, 1)
Erythrobasidium (1, 1) Naumovozyma (1, 1) Trigonopsis (1, 1)
Fellomyces (1, 1) Ogatea (11, 19)* Trimorphomyces (1, 1)
Fibulobasidium (1, 1) Pachysolen (1, 1) Udeniomyces (1, 1)
Filobasidiella (1, 1) Peterozyma (1, 1) Wanderwaltozyma (1, 1)
Filobasidium (1, 1) Pichia (1, 1) Wickerhamia (1, 1)
Geotrichum (1, 1) Priceomyces (1, 1) Wickerhamiella (1, 1)
Hanseniaspora (1, 1) Pseudozyma (1, 1) Yamadazyma (1, 1)
Holtermannia (1, 1) Rhodosporidium (1, 1) Yarrowia (1, 1)
Hyphopichia (2, 2) Rhodotorula (3, 4) Zygoascus (1, 1)
Itersonilia (1, 1) Saccharomyces (5, 54)* Zygosaccharomyces (5, 24)*
Kluyveromyces (4, 27)* Saccharomycodes (1, 3) Zygotorulaspora (2, 2)
Kockovaella (1, 1) Saccharomycopsis (1, 1) Xanthophyllomyces (1, 1)
Kodamaea (1, 1)
* Чувствительны C. intermedia (1), K. dobzhanskii (3), L. fabianii (6), L. jadinii (3), O. wickerhamii (2), Sacch. bayanus (7), см. также табл. 3, S. etchelsii (1), Z. rouxii (4). Эти виды и штаммы не входят в количества, указанные в таблице.
растали при внесении в среду 100 мл/л глицерина или 2% №С1. Согласно этим результатам тестирование основной массы культур микроорганизмов на чувствительность к агенту, секретируемо-му штаммом ВКМ У-1868, осуществлено на забу-ференной глюкозо-пептонной среде [6] с рН 7.0 и 2% ШС1.
Данный штамм не проявлял активности против каких-либо из обследованных 47 видов (42 рода) базидиомицетных дрожжей (табл. 1), а
среди аскомицетных дрожжей спектр его действия довольно ограничен. У последних из проверенных 160 видов (63 рода) только 20 оказались чувствительны, причем это были лишь отдельные или даже единичные виды родов (табл. 1, 2). Более того, обнаружены и виды, также гетерогенные в этом отношении. Так, из обследованных 53 штаммов Saccharomyces cerevisiae Meyen ex Hansen слабо чувствительны к агенту, продуцируемому K. lactis ВКМ Y-1868, около четверти штаммов, а
среди 55 штаммов Wickerhamomyces anomalus (Hansen) Kurtzman et al. — свыше 40% (табл. 3, 4).
Штамм ВКМ Y-1868 обычно не активен против актиномицетов и бактерий (табл. 5), за исключением штаммов Alcaligenes faecalis (Castellani et Chalmers) Austin et al., Paracoccus alcaliphilus Ukarami et al., Sporosarcina ureae (Beijerinck) Kluyver et van Niel и Stenotrophomonas maltophila (Hugh) Palleroni et Bradbury. Слабые зоны подавления роста вокруг культуры ВКМ Y-1868 на за-буференной среде (рН 7.0) наблюдались также на газонах Brevibacterium stationis (ZoBell et Upham) Breed, P. denitrificans (Beijerinck et Minkman) Davis emend. Rainey et al., P. methyluteus Doronina et al. и P. solventivorans Siller et al. emend. Lipski et al.
Для наработки антифунгального агента штамм ВКМ Y-1868 выращивали 5 сут в статическом режиме. Полученная культуральная жидкость обладала фунгицидной активностью (рисунок). Анти-фунгальный агент не проходил через диализную мембрану ("Spectrum", США), не пропускающую соединения с молекулярной массой более 8 кДа. Активность культуральной жидкости утрачивалась после 3 мин прогревания при 100°С или действии протеазой XIV из Streptomyces griseus ("Sigma"), проназами Р и Е ("Serva"), но сохранялась после обработок пепсином, лизоамидазой и протеазой XIII из Aspergillus saitoi ("Sigma").
В результате УФ облучения культуры ВКМ Y-1868 более половины (56%) из случайно ото-бранныхa выросших колоний утратили активность. Они были нечувствительны к агенту, секретируемо-му родительским штаммом. Как и родительский штамм, полученные клоны образовывали зоны подавления роста у вышеуказанных прокариот.
ОБСУЖДЕНИЕ
Термолабильность, чувствительность к про-теолизу и значительная молекулярная масса фун-гицидного агента, секретируемого штаммом K. lactis ВКМ Y-1868, свидетельствуют о его белковой природе. Эти характеристики и активность лишь против дрожжевых грибов позволяют отнести его к микоцинам [7]. Успешная элиминация антифунгальной активности УФ облучением предполагает, что у штамма ВКМ Y-1868, как и у других микоциногенных изолятов K. lactis, синтез микоцина детерминирован внехромосомными генетическими элементами. Аналогично ранее изученным таким штаммам этого вида для штамма ВКМ Y-1868 также высока эффективность элиминации активности после облучения УФ.
Штамм ВКМ Y-1868 значительно, однако, отличается от них в нескольких отношениях. Мико-цины уже известных штаммов действуют в диапазоне рН среды от 5 до 7 с оптимум около 6 [6, 8], тогда как диапазон рН действия микоцина штамма ВКМ
Таблица 2. Роды, включающие чувствительные и нечувствительные к микоцину Шыууеготусея ¡асПз ВКМ У-1868 виды
Чувствительные Нечувствительные
Kazachstania barnettii (1)
K. exigua (2)
Kazachstania africana (1) K. kunashiriensis (1)
K. bovina (1) K. lodderae (2)
K. viticola (1) K. rosinii (1)
K. sloofiae (1)
Nakaseomyces delphensis (1) K. spencerorum (2)
K. transvaalensis (1)
Nakazawaea holstii (5) K. unispora (3)
K. yakushimaensis (1)
Wickerhamomyces bisporus (1)
W. bovis (1) Wickerhamomyces alni (2)
W. canadensis (1) W. anomalus (32)*
W. chambardii (1) W. cife
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.