МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 80, № 3, с. 411-423
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.113
МИКРО- И НАНОЧАСТИЦЫ КОНДЕНСИРОВАННОЙ ДНК, ОБРАЗУЮЩИЕСЯ В ПЦР с Та^-ПОЛИМЕРАЗОЙ В ПРИСУТСТВИИ
ПЛАЗМИДНЫХ МАТРИЦ
© 2011 г. В. Н. Данилевич*, Е. А. Василенко*, Е. В. Печникова**, О. С. Соколова**, Е. В. Гришин*
* Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва ** Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Москва Поступила в редакцию 22.06.2010 г.
Ранее было обнаружено, что в ПЦР с геномными ДНК микроорганизмов и плазмидными матрицами образуются микро- и наночастицы из конденсированной ДНК. Исходно для получения микрочастиц использовали термостабильную КепТад-полимеразу — делеционный вариант Тад-полимеразы. В настоящей работе мы показали, что Тад-полимераза также способна эффективно формировать частицы конденсированной ДНК в ПЦР. Используя технику электронной микроскопии, выявлены различные морфотипы микрочастиц (более четырех), образующихся в ПЦР с буферными растворами различного состава в присутствии Тад-полимеразы и плазмидных матриц различной структуры. Показано, что увеличение числа циклов ПЦР (в случае некоторых ампликонов) приводит к наработке большого количества нанофиламентов и большого количества электроноплотных сферических наночастиц. Найдены условия ПЦР, в которых идет формирование преимущественно дисков (или эллипсоидов) микронного диаметра и нанометровой толщины. Показано, что морфология микрочастиц, образующихся в присутствии Тад-полимеразы, зависит от уровня синтеза в ПЦР одноцепочечных фрагментов ДНК. С помощью нуклеазы 81 установлено, что одноцепочечные молекулы ДНК (наряду с двуцепочечными ДНК ампли-кона) входят в состав микро- и наночастиц и абсолютно необходимы для их формирования. В свете полученных данных обсуждается механизм формирования микро- и наночастиц в ПЦР.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция (ПЦР), Тад-полимераза, ШепТад-полимераза, конденсация ДНК, микрочастицы и наночастицы конденсированной ДНК, эпифлуоресцентная микроскопия, электронная микроскопия.
Известно, что в составе вирусов и клеток ДНК находится в виде компактных агрегатов высокой плотности, т.е. в конденсированной форме. В конденсированном состоянии плотность упаковки ДНК на несколько порядков выше плотности ДНК в растворе. Проблеме конденсации ДНК посвящено достаточно много исследований. Конденсация ДНК in vitro является хорошей модельной системой для изучения механизмов конденсации в живых системах. Изучение механизмов конденсации ДНК важно для понимания молекулярных механизмов регуляции таких биологических процессов как репликация и транскрипция.
Конденсация двуцепочечных ДНК in vitro при комнатной температуре может быть индуцирована различными лигандами, в частности, полиаминами (спермин, спермидин) [1, 2] или катионами трехвалентных металлов (например, гексамином кобальта —
(Co(NH3)+++) [3—7]. Ранее было показано, что в
водных растворах катионы Mg2+ не способны вызы-
1 Адрес для корреспонденции (e-mail: dan@mx.ibch.ru).
вать конденсацию двуцепочечных ДНК [8] и даже приводят к обратному процессу — ее деконденсации [4]. В то же время катионы М§2+ и другие двувалентные катионы могут служить конденсирующими агентами в растворах с низкой диэлектрической константой, например, в водно-спиртовых смесях [7]. Механизм индуцированной лигандами конденсации ДНК в настоящее время достаточно хорошо изучен [9—11].
Ранее нами описан феномен образования конденсированных форм ДНК (микро- и наночастиц) в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) [12—14]. Микро- и наночастицы образуются на поздних стадиях ПЦР, в которой используются генспецифиче-ские и/или неполностью комплементарные олиго-нуклеотидные праймеры, а матрицей служит геномная ДНК микроорганизмов или плазмидные ДНК.
Первоначально для получения микрочастиц мы использовали, главным образом, ШепТад-полиме-разу. Этот фермент является делеционным мутантом Тад-полимеразы, состоящей из 832 аминокислотных остатков [15]. У ШепТад отсутствует М-конце-вой фрагмент исходного фермента, размером 235
аминокислотных остатков, определяющий 5' —3'-экзонуклеазную активность [16]. К1впТад-поли-мераза, по сравнению с Тад-полимеразой, отличается более высокой точностью копирования матрицы [16].
Микрочастицы ДНК, образующиеся в ПЦР, характеризуются достаточно высокой стабильностью в воде [13, 14]. С другой стороны, они легко разрушаются (диссоциируют) уже в присутствии низких концентраций (1 мМ) ЭДТА [13, 14]. При этом основным продуктом диссоциации является линейная двуцепочечная ДНК, фланкированная праймерами (т.е. ДНК ампликона). Факт разрушения микросфер в присутствии ЭДТА указывает на важную роль катионов М§2+, входящих в состав буфера для ПЦР, в формировании микросфер и в стабилизации их структуры. Наличие катионов металлов (М§2+ и К+) в составе микрочастиц определяет, кроме того, их способность поглощать электроны, что позволяет визуализировать эти структуры с помощью электронной микроскопии без контрастирования ура-нилацетатом.
Микрочастицы конденсированной ДНК, образующиеся в ПЦР отличаются рядом особенностей. Они имеют уникальную морфологию и уникальную ультраструктурную организацию. Так, микрочастицы, полученные в ПЦР на матрице геномной ДНК дрожжей с КвяТа^-полимеразой, представляют собой электроноплотные микросферы с многочисленными шипами, их средний диаметр составляет около 1 мкм [13]. Если же в качестве матриц использовать плазмидные ДНК, то в ПЦР с ШвпТад образуются крупные микросферы (около 3 мкм в диаметре) нескольких морфотипов и агрегаты из этих микросфер [14]. В тех случаях, когда в качестве матриц для ПЦР были использованы геномные ДНК бактерий, имела место наработка с помощью ШвпТад гетерогенных по размеру микросфер, их диаметр варьровал от 1 до 7 мкм [14]. Однако наиболее важной особенностью микрочастиц, образующихся в ПЦР, является то, что они состоят как из двуцепочечных (ДНК ампликона), так и одноцепо-чечных фрагментов ДНК [17]. Роль последних в формирования микросфер предстоит выяснить.
Предварительные эксперименты показали, что Тад-полимераза значительно менее эффективна в отношении образования микрочастиц по сравнению с ШвпТад, хотя принципиальная возможность наработки микрочастиц в ПЦР с помощью Тад-по-лимеразы была нами продемонстрирована [14].
Целью настоящей работы было выяснить условия и закономерности формирования микро- и наночастиц в ПЦР с плазмидными матрицами в присутствии термостабильной Тад-полимеразы, изучить их структуру (ультраструктуру) с помощью электронной микроскопии, а также определить роль одноцепочечных фрагментов ДНК в формировании микро- и наночастиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Образцы матричных ДНК, использованные в работе. Препараты плазмидных ДНК были получены при помощи набора реактивов Wizard согласно протоколу фирмы-производителя "Promega", США. В работе были использованы плазмиды pBS::IST2, pBS::ISAfe1 и pBS::ISAfe600 -производные pBlueScriptIIsk+ со вставками ин-серционных элементов IST2, ISAfel и ISAfe600 из Acidithiobacillus ferrooxidans, их размеры составляли 1400, 1250 и 600 п.о. соответственно [18]. Препараты плазмидных ДНК (около 500 нг/мл) разводили в 200 раз дистиллированной водой; для ПЦР брали 1 мкл аликвоты из разведений на 50 мкл реакционной смеси.
Процедура ПЦР. ПЦР-амплификацию IS-эле-ментов проводили с помощью праймеров E1.1f + + E1.2r и E2.1f + E2.2r [14]. Состав буферных смесей для ПЦР а также режим ПЦР и структура праймер-ных олигонуклеотидов приведены ранее [14]. Линейные двуцепочечные ДНК-продукты ПЦР, а также плазмидные ДНК анализировали методом электрофореза в 0.8-1.0% агарозном геле [19].
Методика выделения и очистки микрочастиц ДНК подробно описана ранее [13].
Окрашивание микрочастиц ДНК флуоресцентными красителями и флуоресцентная микроскопия образцов. Микрочастицы, полученные в ПЦР прокрашивали флуоресцентными красителями-интерка-ляторами, главным образом иодистым пропидием (PI). Процедура окрашивания описана ранее [13]. После инкубации с PI, ПЦР-смеси обрабатывали в стандартных условиях, а осадки конденсированной ДНК суспендировали в дист. воде. Образцы микрочастиц изучали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа Olympus CK40 (Германия). Подробности описаны ранее [13].
Электронную микроскопию тотальных препаратов нано- и микрочастиц ДНК проводили на микроскопе Tecnai G2 spirit twin ("FEI Сompany", Голландия) с цифровой камерой Camera Block Mega View III. Для приготовления препаратов по 5 мкл водной суспензии микрочастиц наносили на медные сеточки (Cupper grids) с подложкой из пиолоформа и высушивали при комнатной температуре до полного удаления влаги. Препараты просматривали при ускоряющем напряжении 120 кВ.
Обработка микрочастиц ДНК нуклеазой S1. В работе использовали препарат нуклеазы S1 (100 ед. акт./мкл, "Fermentas", Литва). К 30 мкл раствора ДНК или водной суспензии микросфер добавляли 8 мкл 5х буфера для нуклеазы S1 ("Fermentas", Литва) и 2 мкл разбавленного в 100 раз раствора фермента (2 ед. акт.), общий объем смеси — 40 мкл. Инкубацию микрочастиц с нуклеазой проводили при 37°C в течение 1 ч. Реакцию останавливали добавлением к реакционной смеси 200 мкл дистиллированной воды. После этого пробирки центрифугировали
Рис. 1. Отдельные суперкрупные микрочастицы, а также агрегаты из сросшихся микрочастиц, образовавшиеся в ходе ПЦР-амплификации (30 циклов) элемента КАеЦа, б) и КТ2 (в, г) с помощью Тад-полимеразы. На снимках (в, г) микрочастицы окружены флуоресцирующей полупрозрачной сферой. Микрочастицы окрашены Р1, (а) и (в) — изображение в проходящем белом свете; (б) и (г) — флуоресценция в красной области спектра. Размер масштабной линейки — 20 мкм.
Г * « а 1 1 9 iL в , ,
Ф ■4 * ф а г , ,
при 12000 об/мин (центрифуга Eppendorf) в течение 75 с. Полученные осадки промывали водой (200 мкл) и на конечной стадии суспендировали в 30—40 мкл дистиллированной воды. Аликвоты реакционной смеси (5 мкл) отбирали для световой и электронной микроскопии.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Формирование суперкрупных микрочастиц в присутствии Taq-полимеразы (результаты ранних
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.