МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 358-363
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.66:623.459
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕГРАДАЦИЯ РЕАКЦИОННЫХ МАСС ИПРИТА: ВЫДЕЛЕНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ, АНАЛИЗ ОРГАНИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ РЕАКЦИОННЫХ МАСС И ИХ БИОДЕСТРУКЦИЯ
© 2004 г. И. Т. Ермакова*, Н. С. Сафрина*, И. И. Старовойтов*, Е. В. Лшбунь**, А. А. Щербаков**, О. Е. Макаров**, А. А. Петрова***, П. А. Шпильков***
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов ***Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный институт технологии органического синтеза, Шиханы, Саратовская область Поступила в редакцию 25.02.03 г.
Выделены и селекционированы штаммы бактерий, растущие в среде с реакционными массами (РМ) иприта в качестве источников углерода. Прекращение роста в этой среде при наличии остаточного углерода связано с исчерпанием биоутилизируемых субстратов, в первую очередь, моноэтанолами-на (МЭА) и этиленгликоля (ЭГ), а не вследствие накопления токсичных продуктов метаболизма в культуральной жидкости или клетках. Проведена идентификация и анализ 1,4-пергидротиазинов (ПГТ) в РМ, которые являются ее основными компонентами, образующимися в процессе химической детоксикации иприта. Преобладающим компонентом в смеси ПГТ является К-(2-гидроксиэ-тил)-2-метил-1,4-пергидротиазин гидрохлорид. Снижение концентрации всех ПГТ в процессе роста культуры достигает 50%. Деструкция пергидротиазинов является результатом жизнедеятельности микроорганизмов.
Ключевые слова: иприт, реакционные массы, микробиологическая деградация, 1,4-пергидротиазины.
Для решения проблем, связанных с уничтожением отравляющих веществ (ОВ) кожно-нарывного действия (иприт, люизит, ипритно-люизит-ные смеси) в России разработана технология, в основе которой лежит их химическая детоксика-ция с образованием малотоксичных РМ и уничтожение последних путем сжигания или битумиро-вания с последующим захоронением битумных блоков на полигонах. Однако оба метода экологически небезопасны, так как при сжигании образуются летучие токсичные аэрозоли, а в технологии битумирования не решены такие вопросы как устойчивость битумированных блоков при их длительном хранении и генотоксичность соединений, содержащихся в этих блоках.
Достаточную степень экологической безопасности при уничтожении ОВ может обеспечить применение биотехнологических методов, в основе которых лежит деструктивная активность микроорганизмов, осуществляющих минерализацию токсикантов.
Разработан биотехнологический метод уничтожения иприта путем щелочного гидролиза до тио-дигликоля с последующей биоутилизацией последнего [1], изучены условия и механизм биодеструкции этого соединения селекционированным активным штаммом бактерий Alcaligenes хуЪзоху-
dans subsp. denitrificans ТД2 [2, 3]. Разработан химико-биотехнологический способ уничтожения РМ ипритно-люизитных смесей, на конечной стадии которого утилизация органических соединений осуществляется ассоциацией микроорганизмов, адаптированных к этим источникам углерода [4].
Использование способности микроорганизмов к деструкции широкого спектра ксенобиотиков может сыграть важную роль в решении вопросов, связанных с очисткой территорий, которые могут быть загрязнены ОВ или продуктами их детоксикации в местах хранения, транспортировки и уничтожения химического оружия в результате возможных утечек, аварийных выбросов и т.д.
Разработан метод фиторемедиации почв, загрязненных РМ иприта, с использованием ряда растений, способных аккумулировать из почвы серусодержащие компоненты и тем самым снижать их содержание в 3-5 раз при обычном выращивании и в 20-25 раз при обработке посевов этих растений растворами фитогормонов [5]. Интродукция в такие почвы микроорганизмов, способных к биоутилизации или трансформации продуктов детоксикации иприта, может во много раз увеличить степень очистки почв, подвергая эти вещества полной минерализации или трансформации в менее токсичные соединения.
Разработанный и принятый в России способ детоксикации иприта предусматривает использование дегазирующей смеси, в состав которой входят МЭА и ЭГ (9 : 1), позволяющей проводить процесс без газовых выделений. Продукты детоксикации иприта в составе образующихся РМ относятся к умеренно опасным соединениям III-IV классов токсичности (ЛД50 = 7000 мг/кг). Результаты физико-химических анализов показали, что большую часть продуктов детоксикации составляют ПГТ, которые образуются в результате взаимодействия иприта с МЭА. Содержание гидрохлорид К-(2-гидроксиэтил)пергидротиазина в РМ составляет 31.2% и К-(2-гидроксиэтил)-2,6-диме-тилпергидротиазина - 18%. Кроме того, в РМ иприта обнаружен олигомер, который образуется при взаимодействии иприта с ЭГ - этиленхлорги-дрин и не вступившие в реакции (взятые с избытком) МЭА и ЭГ [6].
Целью настоящей работы является поиск и селекция микроорганизмов, способных к биоутилизации и трансформации органических компонентов РМ иприта, образующихся в процессе его химической детоксикации, анализ этих компонентов и определение деструктивной активности селекционированных микроорганизмов в отношении этих соединений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы штаммы бактерий Pseudomonas putida, растущие в минеральной среде с PM иприта в качестве источников углерода, 2 штамма Alcaligenes xylosoxydans subsp. denitir-ficans - деструкторов тиодигликоля, а также 8 штаммов бактерий Pseudomonas putida -деструкторов разных ксенобиотиков из коллекции микроорганизмов лаборатории метаболизма ксенобиотиков ИБФМ РАН.
Культивирование бактерий проводили при 30°C в колбах с жидкой минеральной средой MS [2] на качалке (220 об/мин).
В качестве источников углерода использовали РМ (IV класс токсичности), образующиеся в результате детоксикации иприта с использованием дегазирующей смеси, содержащей МЭА (90%) и ЭГ (10%), которые были получены из Государственного института технологии органического синтеза (ГИТОС, г. Шиханы, Саратовская обл.). РМ вносили в минеральную среду в количестве 1% (об/об) непосредственно перед началом культивирования. Кроме того, в качестве субстратов использовали смесь МЭА и ЭГ соответственно, 0.25 и 0.025% (концентрации рассчитывали исходя из содержания этих компонентов в РМ), а также каждый из этих компонентов в отдельности (0.25%) и глутамат (1%).
В качестве посевного материала использовали клетки, выращенные на агаризованной среде MS с 1% PM иприта.
Рост культуры контролировали по изменению оптической плотности на спектрофотометре Spe-col при X = 560 нм (ОП560) и числу колониеобразу-ющих единиц (КОЕ) путем высева из разведений на агаризованную среду М7 (аналог МПА).
Анализ состава органических компонентов РМ иприта в процессе культивирования бактерий проводили хроматографическими и хромато-масс-спе-ктрометрическими методами. Водные образцы культуральной жидкости подвергали экстракции органическими растворителями: хлороформом, бензолом, гептаном, эфиром. Полученные экстракты сушили в токе аргона и хроматографирова-ли на газожидкостном хроматографе Биохром-1 с плазменно-ионизационным микродетектором. Использовали кварцевую капиллярную колонку (ККК) с фазой SE-54. Хроматографирование осуществляли с программированием температуры рабочей камеры в диапазоне 100-270°C со скоростью 8°С/мин, температура камеры впрыскивания 200°C, детектора 270°C.
Последующую идентификацию индивидуальных веществ в соответствии с хроматографическими пиками проводили на ГЖХ (модель HP 5890 фирмы "Hewlett Packard", США) с масс-спектрометром. С этой целью использовали ККК с фазой, содержащей 5% дифенила и 95% диметилпо-лисилоксана в описанных выше температурных условиях. Полученные масс-спектры анализировали с помощью базовых данных программы Wiley 275.L.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для выделения микробных культур, способных к утилизации органических компонентов РМ иприта, были использованы образцы почв, загрязненных продуктами детоксикации кожно-нарывных ОВ (г. Шиханы, Саратовской обл.). Почва помещалась в стеклянную колонку с боковыми отводами для поступления воздуха, через которую периодически пропускали разбавленный 1 : 100 раствор РМ иприта. После первого этапа селекции, длившегося несколько месяцев, была выделена микробная ассоциация, которая активно росла в жидкой минеральной среде с теми же источниками углерода.
Второй этап селекции проводили путем культивирования выделенной ассоциации в жидкой среде с РМ иприта с регулярными пересевами в свежую среду в период экспоненциального роста в течение 3 мес. Отселекционированные штаммы бактерий росли в той же среде с удельной скоростью роста 0.02-0.04 ч-1. Они были идентифици-
ОП560 1.6
KOE, n х 109 400
300
200
Н100
0
50
100
150
200
0.02
Рис. 1. Динамика роста культур P. putida SH в среде с РМ иприта (1 - ед. ОП560, 2 - количество КОЕ) и P. putida SH1 в среде с РМ иприта (3 - ОП560, стрелкой отмечено внесение в среду МЭА + ЭГ) и МЭА + + ЭГ (4 - ОП560).
рованы согласно определителю Берги [7] как Pseudomonas putida.
Изучение динамики роста в среде с РМ иприта одного из таких штаммов P. putida SH показало, что при переходе культуры из экспоненциальной фазы в стационарную происходит резкое снижение оптической плотности и числа жизнеспособных клеток (до 80%), что может быть обусловлено как накоплением в культуральной жидкости или клетках токсичных веществ, вызывающих их лизис, так и особенностями самой культуры (рис. 1, кривые 1, 2).
Третий этап селекции выделенных штаммов осуществляли путем последовательных пересевов клеток, оставшихся жизнеспособными в глубокой стационарной фазе (до 2 нед.). В результате нескольких пассажей был отобран штамм P. putida biovar A SH1, который был достаточно устойчив к лизису клеток в заданных условиях (рис. 1, кривая 3).
Как показали данные проведенных экспериментов, количество вносимой в среду РМ оказывает влияние на ростовые характеристики штамма. В диапазоне концентраций РМ с 0.5 до 3.0% биомасса бактерий увеличивалась от 0.8 до 2.4 ед. ОП, тогда как удельна
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.