МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 5, с. 694-701
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.8.083.(268.45-210.1)
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРИОПЭГОВ ВАРАНДЕЙСКОГО ПОЛУОСТРОВА НА ПОБЕРЕЖЬЕ БАРЕНЦЕВА МОРЯ
© 2007 г. С. А. Печерицыша***1, В. А. Щербакова**, А. Л. Холодов***, В. Н. Акимов**, Т. Н. Абашина***, Н. Е. Сузина**, Е. М. Ривкина***
*Пущинский государственный университет **Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино ***Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино
Поступила в редакцию 28.08.2006 г.
В работе дана микробиологическая характеристика водонасыщенных горизонтов в вечномерзлых грунтах - криопэгов, обнаруженных на полуострове Варандей (побережье Баренцева моря) на глубине 4-20 м. Общая численность бактерий в воде криопэгов составила 3.5 х 108 клеток/мл. Популяция культивируемых аэробных гетеротрофных бактерий насчитывала 3-4 х 107 клеток/мл, а число анаэробных гетеротрофных бактерий варьировало от 102 до 105 клеток/мл в зависимости от температуры культивирования и солености среды. Сульфатредуцирующие бактерии обнаруживали в количестве сотен, а метанобразующие археи - десятков клеток в 1 мл воды. Из скважины 21 выделена и охарактеризована чистая культура сульфатвосстанавливающей бактерии штамм В15. Филогенетический анализ показал, что новая бактерия является представителем рода Ве&'и1/оУ1Ьг1о с ближайшим родственником Ве&'и1/оУ1Ьг1о техгсапш' (96.5% сходства). Но значительные фенотипические отличия позволяют предположить, что штамм В15 представляет новый вид сульфатвосстанавливающих бактерий.
Ключевые слова: криопэги, вечная мерзлота, психрофильные бактерии, сульфатвосстанавливаю-щие бактерии, Desulfovibrio sp., Psychrobacter sp., Pseudomonas sp.
Криопэги представляют собой незамерзшие грунты и линзы свободной воды, находящиеся в толще многолетнемерзлых пород и характеризующиеся постоянно отрицательной температурой. Эти образования широко распространены в Арктике. Происхождение криопэгов связано с промерзанием отложений морского генезиса различного возраста, и их соленость определяется, в первую очередь, температурой. Существенное влияние на минерализацию некоторых криопэгов оказывает также участие в их образовании поверхностных пресных вод. Ранее выполненные нами микробиологические исследования линз высокоминерализованных (170 г/л) криопэгов, обнаруженных в районе озера Якутское Колымской низменности показали, что эти экосистемы являются местообитанием пси-хрофильного галотолерантного микробного сообщества [1]. Из этих образцов были выделены и охарактеризованы новые таксоны психрофильных и психротолерантных бактерий [2, 3]. Исследование физиолого-биохимических свойств изолятов показало, что бактерии не только выживают в условиях отрицательных температур и высокой солености среды, но и остаются там метаболически активными [4, 5]. Численность сульфатвосстанавливающих
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: pecheiicyna@ibpm.push-
chino.ru).
бактерий в этих криопэгах составляла до 106 клеток в 1 мл воды, однако получить чистые культуры этих прокариот не удалось.
Цель настоящей работы состояла в определении численности бактерий различных физиологических групп и поиске новых сульфатвосстанавливающих бактерий в образцах водонасыщенных горизонтов полуострова Варандей.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Район и объект исследования. Исследования проводились на Варандейском полуострове (побережье Баренцева моря) в августе 2004 г. На рис. 1 приведена схема расположения скважин, из которых были взяты образцы для микробиологических исследований.
Мерзлота на участке исследований была трех типов: верхний слой новообразованной (т.е. промерзшей в течение последних 5-6 тыс. лет) мерзлоты мощностью 4-5 м (рис. 1, 1); слой охлажденных водонасыщенных засоленных осадков (рис. 1, 2); реликтовая мерзлота плейстоценового возраста (рис. 1, 3). Последняя также может содержать линзы криопэгов. Температура верхнего мерзлого горизонта в летнее время не превышает -2°С в пределах прибрежной отмели и -3°С на морской террасе.
25/04
20-21/04
■ "{ // / У 4
ш
3/04 10/04
ШШй
Уровень моря
Рис. 1. Схема расположения скважин на участке исследования: 1 - пески прибрежно-морского генезиса; 2 - переслаивание песков и супесей; 3 - супеси морского происхождения.
% * * ч,'
* \т
• *«
г 1 V * 1л Л " ■ -1
7 '. ' 1 л 1 >1 ■
* * л 4 Ч * гг в , /
" Л < V V- /I»
щ — ф 1 1 1 4 % ' •»! £ / 1. .и»
Рис. 2. Клетки бактерий, выделенных из криопэгов полуострова Варандей: а - грамположительные палочки и б - гра-мотрицательные коккобациллы, образующие колонии при -2°С; фазовый контраст, длина масштабной линейки 10 мкм; в - негативно окрашенные клетки сульфатредуцирующей бактерии штамма В15, длина масштабной линейки 1 мкм.
В целом участок характеризуется среднегодовой температурой пород -2.. .-5°С.
Верхний горизонт мерзлоты был вскрыт двумя скважинами 3 и 10 в пределах отмели и двумя скважинами 21 и 25 на морской террасе. Разрез представлен песками прибрежно-морского генезиса с линзами илистых отложений. Все отложения засолены и содержали метан (в песках 0.2-12 мл/кг, в илистых отложениях до 22 мл/кг). Поэтому мож-
но предположить, что их формирование происходило в анаэробных условиях.
Межмерзлотный горизонт напорных подземных вод был вскрыт всеми скважинами на глубинах 4-6 м в пределах отмели и 4-8 м на морской террасе. Общая минерализация составляла от 6 до 18 г/л. Столь низкая соленость вод объясняется, по всей видимости, распреснением горизонта за счет инфильтрации атмосферных осадков и поверхностных вод по подозерным таликам. По составу
Удельная скорость роста, ч 1 (а)
10 20 30 40 Температура, °C
0 5 10 15 20 25
Концентрация №С1, г/л
Рис. 3. Влияние температуры (а) и солености (б) на рост штамма В15.
воды преимущественно хлоридно-натриевые, и только в одной скважине отмечены сульфатно-натриевые (табл. 1). Воды характеризовались нейтральными значениями рН (6.8-7.8) и низким содержанием 02 (0.3-0.7 мг/л).
Отбор проб. Методика стерильного отбора проб при колонковом бурении мерзлых пород станком УКБ-12/25 детально отработана [6, 7]. Среду для накопительных культур инокулировали водой криопэ-гов сразу после отбора проб. Отобранные пробы хранили замороженными до начала анализов.
Состав сред и методы учета численности бактерий. Общую численность микроорганизмов определяли путем прямого счета на фильтрах при окраске эритрозином. Аэробные гетеротрофные бактерии учитывали на агаризованной среде 5/5 следующего состава: аминопептид - 60 мл, триптон - 5 г; дрож-
жевой экстракт - 1 г; соевый экстракт 30 мл; агар-агар - 20 г; вода дистиллированная 1 л. Определение численности производили путем подсчета колоний, выросших на 20 и 40-е сут инкубирования (-2°С), 14-е и 21-е сут инкубирования (5°С), 5-е и 10-е (20°С) и 3-и и 6-е (37°С).
Численность жизнеспособных анаэробных бактерий различных физиологических групп определяли методом предельных разведений. Температура инкубирования - 5 и 20°С. Подсчет производили через 14 и 21 сут в случае инкубирования при 20°С, и через 45 и 60 сут при 5°С. Численность анаэробных гетеротрофных бактерий с бродильным типом метаболизма определяли на среде следующего состава, (г/л): KH2PO4 - 0.7; K2HPO4 - 0.7; NH^Cl - 0.5; MgSO4 ■ 7H2O - 0.1; NaCl - 1.0; аскорбат Na - 1.0; глюкоза - 2.0; пептон - 2.0. О наличии роста судили по увеличению оптической плотности в области 600 нм.
Численность сульфатредукторов определяли на среде, содержащей (г/л): KH2PO4 - 0.33; KCl - 0.33; NaCl - 2.0; NH4Cl - 0.33; MgCl2 - 0.33; CaCl2 - 0.33; Na2SO4 - 4.0; раствор микроэлементов SL-10 [8] -10 мл; раствор витаминов по Волину [9] - 5 мл; лактат - 2.0. О росте судили по появлению сероводорода.
Метаногены учитывали по приросту метана на среде 141 [8] с ацетатом (2 г/л) и Н2 + СО2 (80 : 20).
Для определения численности ацетогенов использовали среду следующего состава, (г/л) NH4Cl - 1.0; Mga2 ■ 6H2O - 0.1; CaCl2 ■ 2H2O - 0.1 NaCl - 0.9; K2HPO4 - 0.4; дрожжевой экстракт - 0.1 триптон - 3.0; Na2S ■ 9H2O - 0.25; цистеин - 0.4; раствор микроэлементов к среде 141, [8] - 10 мл; NaHCO3 - 0.2; резазурин - 0.001; бромэтансульфо-новая кислота - 2.0. Субстрат Н2 + СО2 (80 : 20). Присутствие ацетатобразующих бактерий устанавливали по наличию ацетата в культуральной жидкости.
Полученне накопительных и чистой культур сульфатредуцирующих бактерий. Накопительная культура штамма В15 была получена путем инокуляции 20 мл среды 10 мл пробы криопэга и инкубировании при температуре 15°С. Накопительные культуры, в которых наблюдали образование сероводорода, использовали как посевной материал для
0
Таблица 1. Гидрохимические характеристики подземных вод на участке исследований
№ скважины Глубина отбора,м Минерализация, мг/л рН Катионы, мг/л Анионы, мг/л
K+ Na+ Mg2+ Ca2+ Cl- so2- HCO3
3 4 10602.6 7.1 56.0 3278.9 360.0 120.0 5680.0 480.0 622.2
10 3.5-4 6237.9 7.8 55.8 1485.1 324.0 60.0 2130.0 48.0 2135.0
21 9.0 9301.1 7.4 650.0 32.2 1008.0 960.0 2122.9 3613.0 915.0
25 3.5 18662.9 6.8 213.0 4359.4 1080.0 280.0 5786.5 4992.0 1952.0
последующих пересевов и десятикратных разведений. Чистая культура штамма В15 была получена, используя метод десятикратных разведений и посева в тонкий слой пристенного агара с последующим пересевом образующихся колоний в жидкую среду.
Накопительную культуру сульфатредуцирую-щей бактерии штамма В15 получали на среде следующего состава (г/л): KH2PO4 - 0.33; KCl - 0.33; NaCl - 2.0; NH4Cl - 0.33; MgCl2 - 0.33; CaCl2 - 0.33; Na2SO4 - 4.0; резазурин - 0.002; раствор микроэлементов SL-10 [8] - 10 мл; раствор витаминов по Волину [9] - 5 мл. После стерилизации добавляли восстановитель Na2S - 0.25 г/л и лактат 2.0 г/л.
Чистую культуру поддерживали на среде, содержащей (г/л): KH2PO4 - 0.33; KCl - 0.33; NaCl - 2.0; NH4Cl - 0.33; MgCl2 - 0.33; CaCl2 - 0.33; Na2SO4 - 4.0; раствор микроэлементов SL-10 [8] - 2 мл; раствор витаминов по Волину [9] - 5 мл. После стерилизации добавляли 25 мл NaHCO3 (10%) и 2.5 мл HCl (25%).
Исследование влияния температуры, рН и солености
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.