ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2010, № 5, с. 560-563
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 591.132:612.015.33:599.32.4
МИКРОБНАЯ АЗОТФИКСАЦИЯ В ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОМ ТРАКТЕ ПЕСЧАНОК КАЛМЫКИИ (Meriones tamariscinus и Meriones meridianus)
© 2010 г. Т. А. Кузнецова*, Н. В. Костина**, Е. И. Наумова*, М. М. Умаров**
*Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33 **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, ф-т почвоведения
E-mail: nvkostina@mail.ru Поступила в редакцию 25.12.2009 г.
У двух видов песчанок — семеноядной полуденной Meriones meridianus и характеризующейся смешанным типом питания тамарисковой M. tamariscinus исследованы азотфиксирующая активность, содержание азота (N) и углерода (C), а также численность микроорганизмов в преджелудке, слепой и ободочной кишках. У полуденной песчанки во всех перечисленных отделах зафиксирована более высокая нитрогеназная активность, чем у тамарисковой, особенно в ободочной кишке (на 1—2 порядка выше аналогичных показателей у исследованных ранее грызунов). Соотношение C/N в содержимом преджелудка у M. tamariscinus выше, чем у M. meridianus, что согласуется с большей ролью зеленых частей растений в ее рационе. Отмечено последовательное увеличение содержания азота от преджелудка к ободочной кишке у M. tamariscinus. По численности микроорганизмов в преджелудке и кишечнике исследованные виды сходны.
К настоящему времени микробная азотфикса-ция была обнаружена в пищеварительном тракте нескольких видов грызунов, потребляющих корма низкой питательной ценности, — красной полевки Clethrionomys rutilus (Наумова и др., 2000), обыкновенной и восточноевропейской полевок Microtus arvalisи M. rossiaemeridionalis (Белов и др., 2002; Варшавский и др. 2004), обыкновенного слепыша Spalax microphtalmus (Варшавский и др., 2003) и речного бобра Castor fiber (Вечерский и др., 2006, 2009; Наумова и др., 2010). Полученные в этих работах результаты позволили предположить, что у мелких млекопитающих дефицит дие-тарного азота в определенной степени может быть компенсирован высокой активностью ди-азотрофных микроорганизмов, населяющих пищеварительный тракт. У всех исследованных видов грызунов основным локусом азотфиксации была ободочная кишка. Однако у M. rossiaemeridionalis при экспериментальном содержании на безбелковых коммерческих кормах уровень азот-фиксации существенно возрос в преджелудке (Мещерский и др., 2004).
Для выяснения особенностей локализации, изменений уровня нитрогеназной активности микросимбионтов и связи этого явления с пищевой специализацией грызунов было предпринято исследование микробной азотфиксации в группе преимущественно семеноядных грызунов — песчанок (Gerbillidae), естественные корма которых богаты белковым азотом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объектов исследования были выбраны два вида песчанок, населяющих Черные земли Калмыкии, — преимущественно семенояд-ная полуденная песчанка M. meridianus (Ралль, 1940) и тамарисковая песчанка M. tamariscinus, потребляющая помимо семян и заметное количество зеленых частей растений (Федянина, 1981). Взрослые животные обоих полов (5 особей тама-рисковых и 8 особей полуденных песчанок) были отловлены с помощью давилок в окрестностях пос. Ачинеры (45°30' с.ш., 45°25' в.д.). В среднем от момента отлова животных до взятия проб проходило 4—8 ч. Образцы отбирали из содержимого следующих отделов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ): преджелудка, слепой и ободочной кишок — основных мест локализации симбионтов. Пробы были помещены в стерильные флаконы с физиологическим раствором. До проведения анализов пробы хранились в холодильнике при 4°C.
Актуальную азотфиксацию в образцах содержимого ЖКТ песчанок и в чистых культурах бактерий на жидкой среде Эшби определяли газово-хроматографическим методом на газовом хроматографе "Кристалл-2000" (Россия) с пламенно-ионизационным детектором (ПИД), длина колонки — 1м, диаметр — 3 мм, наполнитель — Pora-pak N 80/100 (Waters, США), температура колонки — 60°С, детектора — 160°С, испарителя — 100°С, расход газа-носителя (N2) — 50 мл/мин, воздуха — 280 мл/мин, водорода — 28 мл/мин по
классической методике (Методы..., 1991). Активность азотфиксации выражали в нмоль С2Н4/(г • ч).
Содержание азота и углерода в образцах определяли в трех повторностях на элементном анализаторе VarioEL III CHNS (Германия). Образцы содержимого кишечника перед измерением высушивали и измельчали.
Определение общей численности бактерий в разных отделах ЖКТ песчанок проводили с использованием метода люминесцентной микроскопии при окрашивании препаратов акридиновым оранжевым. Десорбцию клеток проводили, обрабатывая водно-почвенные суспензии (1 : 100) на низкочастотном диспергаторе типа УЗДН-1 (Россия) (22 кГц, 0.44 А, 0.5 мин) (Методы., 1991).
Учет численности азотфиксирующих микроорганизмов проводили чашечным методом, для выделения использовали среду Эшби (Ashby's agar medium, Sigma, США). Культивирование микроорганизмов проводили в термостате при 37°C в течение 5—7 сут.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Содержание азота и углерода. Анализ содержания общего азота в ЖКТ песчанок показал, что у M. tamariscinus происходит последовательное увеличение содержания азота от преджелудка к ободочной кишке, тогда как у M. meridianus содержание азота в ободочной кишке снижается (табл. 1). Соотношение углерода и азота в аналогичных отделах у исследованных видов песчанок оказалось весьма близким за исключением преджелудка, в котором у M. tamariscinus баланс оказался смещенным в сторону углерода.
Активность азотфиксации была обнаружена во всех отделах ЖКТ исследуемых видов песчанок (табл. 2), причем ее значения у двух видов достоверно различались (Mann—Whitney U Test Z = = 3.077, p = 0.021), несмотря на значительную вариабельность показателей. Для ЖКТ семенояд-ной M. meridianus характерен более высокий уровень активности азотфиксации с максимальными значениями в ободочной кишке (табл. 2), а диазо-трофная активность в преджелудке и слепой кишке статистически не различалась. У M. tamariscinus максимальный уровень азотфиксации отмечен в преджелудке и слепой кишке, а средние значения активности оказались выше в преджелудке и ободочной кишке.
В чистых культурах микроорганизмов, выделенных из ЖКТ песчанок, функционально значимая диазотрофная активность была выявлена у бактерий родов Bacillus, Bacteroides, коринеформ-ных бактерий, а также у четырех штаммов, предварительно отнесенных к семейству Enterobacte-riaceae (табл. 3).
Таблица 1. Содержание азота и углерода в разных отделах желудочно-кишечного тракта песчанок, %
Элемент Отдел ЖКТ Meriones tamariscinus Meriones me-ridianus
N С C/N Преджелудок 4.79 ± 0.6 36.74 ± 2 . 6 7.87 ± 1.52 5.32 ± 0.91 31.53 ± 2.56 6.02 ± 0.55
N С C/N Слепая кишка 6.06 ± 0.21 32.56 ± 1.69 5.37 ± 0.09 5.85 ± 0.25 30.69 ± 0.68 5.26 ± 0.1
N С C/N Ободочная кишка 6.32 ± 0.47 33.79 ± 2.57 5.35 ± 0.01 4.34 ± 0.38 22.99 ± 0.57 5.33 ± 0.33
Таблица 2. Активность азотфиксации в разных отделах ЖКТ песчанок, нмоль С2Н4/(г • ч)
Вид Преджелудок Слепая кишка Ободочная кишка
Meriones tamariscinus 18.94 ± 11.11 40.88* 6.08 ± 2.59 40.96* 17.17 ± 6.36 23.54*
M. meridi-anus 23.96 ± 6.1 40.25* 24.28 ± 8.5 43.81* 157.69 ± 98.96 348.7*
* Максимальные значения азотфиксации.
Таблица 3. Активность азотфиксации чистых культур микроорганизмов, выделенных из разных отделов ЖКТ песчанок, нмоль С2Н4/(мл ■ ч)
Культура, штамм Активность азотфиксации
Коринеформные бактерии, 1 2.81
Bacillus sp., 1 4.4
Enterobacteriaceae, 1 4.4
Bacillus sp., 2 2.2
Enterobacteriaceae, 2 2.75
Коринеформные бактерии, 2 1.65
Bacteroides sp., 1 1.65
Enterobacteriaceae, 3 2.75
Bacteroides sp., 2 2.75
Bacillus sp., 3 2.95
Enterobacteriaceae, 4 2.11
Bacillus sp., 4 6.32
По данным учета на среде Эшби средняя численность азотфиксирующих микроорганизмов в ЖКТ песчанок составляла 106—105 КОЕ/г. Количество микроорганизмов в разных отделах ЖКТ,
562
КУЗНЕЦОВА и др.
Таблица 4. Численность азотфиксирующих микроорганизмов (метод посева, lgKOE/г)
Вид Преджелудок Слепая кишка Ободочная кишка
Meriones tamariscinus M. meridianus 5.87 (9.41) 5.18 (10.02) 5.79 (9.09) 5.62 (9.41) 5.04 (8.47) 5.57 (9.32)
Примечание. В скобках — общая численность микроорганизмов (метод люминесцентной микроскопии, ^ К/г).
учтенных этим методом, у исследуемых видов песчанок различалось незначительно (табл. 4).
Оценка общей численности микроорганизмов в содержимом ЖКТ методом прямой люминесцентной микроскопии показала, что по количеству микроорганизмов преджелудок обоих видов песчанок превосходит толстый отдел кишечника. Кроме того, ЖКТ семеноядной M. meridianus обильнее населен микроорганизмами по сравнению с M. tamariscinus, дополняющей кормовой рацион зелеными частями растений.
Согласно полученным данным, преджелудок и толстый отдел кишечника у обоих видов песчанок сходны по плотности заселения микроорганизмами.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Против ожидания, максимально высокая азот-фиксирующая активность (в среднем 157.69 нмоль С2Н4/(г • ч) была зафиксирована в ободочной кишке семеноядной полуденной песчанки — на 1—2 порядка выше, чем у ранее исследованных видов зеленоядных грызунов. По-видимому, это обусловлено более низким содержаним азота в содержимом ободочной кишки (4.34 ± 0.38%), что уменьшает ингибирование нитрогеназы конечным продуктом. Ободочная кишка была основным локусом азотфиксирующей активности у всех ранее изученных в этом отношении грызунов (кроме C. fiber). Максимальные значения нитро-геназной активности в ободочной кишке у C. ruti-lus составляли 24.3 нмоль С2Н4/(г • ч) (Наумова и др., 2000), у M. arvalis — 3.39 С2Н4/(г • ч) (Белов и др., 2002), у M. rossiaemeridionalis — 2.27 нмоль С2Н4/(г • ч) (Мещерский и др., 2004), у S. mi-crophtalmus — 5.7 нмоль С2Н^(г • ч) (Варшавский, 2004). Значения активности азотфиксации, полученные для чистых культур бактерий, выделенных из ЖКТ песчанок, оказались сопоставимы с максимальными уровнями нитрогеназной активности в ЖКТ других грызунов, однако были на 1—2 порядка ниже, чем в ЖКТ исследуемых ви
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.