ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 183-190
УДК 579.222+574.24
МИКРОБНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ГЕРБИЦИДА ГЛИФОСАТА (ОБЗОР)
© 2015 г. А. В. Свиридов*, Т. В. Шушкова*, И. Т. Ермакова*, Е. В. Иванова*, **, Д. О. Эпиктетов***, А. А. Леонтьевский*, **
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290 **Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино Московской обл., 142290
e-mail: alhummen@rambler.ru Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
В обзоре рассматриваются вопросы, связанные с механизмами биодеструкции одного из самых широко распространенных гербицидов — глифосата (N-фосфонометилглицина). Глифосат отличается способностью накапливаться в природных средах и проявляет токсические свойства не только в отношении растений, но также животных и бактерий. В обзоре особое внимание уделяется микробной трансформации и минерализации глифосата как единственному пути быстрой деградации этого соединения. Описываются различные пути катаболизма глифосата известными бактериями-деструкторами, относящимися к разным таксономическим группам. Наряду с описанными в литературе ферментами деструкции глифосата С—Р лиазой и глифосат-оксидоредуктазой, рассматривается возможность существования альтернативных путей деградации гербицида. В связи с актуальностью проблемы очистки почв и водоемов, загрязненных глифосатом, обсуждаются вопросы использования бактерий-деструкторов для разработки технологий их биоремедиации.
Ключевые слова: глифосат, N-фосфонометилглицин, метаболизм глифосата, C—P лиаза, глифосат оксидоредуктаза, аминометилфосфоновая кислота, биоремедиация.
DOI: 10.7868/S0555109915020221
Стремительный рост разнообразия и масштабов производства синтетических фосфонатов, — устойчивых соединений, содержащих в своей структуре прямую связь углерод—фосфор (С—Р), сделало их опасными загрязнителями окружающей среды. Наиболее распространенными представителями этой группы ксенобиотиков являются гербициды на основе глифосата (М-фосфонометилглицин, ГФ). ГФ — уникальный ингибитор 5-енолпирувилшики-мат-3-фосфат синтазы (ЕПФС), ключевого фермента шикиматного пути биосинтеза ароматических соединений у растений и некоторых микроорганизмов. Ингибирование ЕПФС подавляет синтез белков и вторичных метаболитов (флавоноиды, лигнин, кумарины) и вызывает дерегуляцию энергетического обмена [1, 2].
Распространению гербицидов на основе ГФ способствовали как появление ГФ-устойчивых трансгенных сортов важнейших сельскохозяйственных культур (соя, рапс, кукуруза, пшеница, сахарная свекла, хлопок и др., — до 90% всех культивируемых трансгенных растений в мире [1]), так и представления о "безвредности" ГФ, основанные на сведениях о его быстрой (в течение 2 недель) деструкции аборигенной микрофлорой почв [3, 4].
Интенсивное применение ГФ привело к его накоплению в почве и водных средах [5, 6]. Более того, стали появляться сообщения о негативном
воздействии ГФ на метаболизм животных, в особенности с учетом хронических и отдаленных по времени эффектов [7]. Основной продукт деструкции ГФ в природе, аминометилфосфоновая кислота (АМФК), вызывает нарушение процессов репарации ДНК и синтеза мРНК у животных и растений [8—10]. При этом и ГФ и АМФК в сублетальных дозах обнаруживаются в плодах и побегах культурных растений [11, 12]. Наконец, первоначальные данные о незначительности воздействия ГФ на почвенную микробиоту [3, 13] были опровергнуты исследованиями, показавшими большое разнообразие физиологических ответов почвенных микроорганизмов на воздействие ГФ [14]. В частности, в почвах, загрязненных ГФ, микробиота проявляла большую устойчивость к его токсическому действию и существенно отличалась от микрофлоры обычных почв по видовому составу [15].
Эффективным способом удаления ГФ из почв и водных сред может стать его биодеградация с помощью аборигенных или интродуцированных микроорганизмов-деструкторов. Однако сведения о метаболических путях катаболизма фосфо-натов у микроорганизмов, их регуляции и свойствах ключевых ферментов весьма ограничены.
Пути катаболизма глифосата. Процессы катаболизма ГФ в большей степени изучены у бактерий, для грибов, растений и животных имеются
O
ho-p-ch2-nh-ch2-cn
OH
' Гф-С";циф", p. + h3c-nh-ch2-c*
OH c-p лиаза Pl + 3 2 OH
Гликофосфат
Саркозин
O2 + H2O -
H,O,
Саркозин оксидаза
O ,O
CO2t + H2O ,Последовательное H-C + h2n—ch2-c'
21 2 окисление ^^ 2 2 OH
Формальдегид Глицин
О-ТГФК-- Биосинтез
Рис. 1. С—Р лиазный путь метаболизма ГФ [35, 51]. ТГФК — тетрагидро-фолиевая кислота.
лишь предварительные сведения о возможных путях его превращения.
Ряд изученных бактерий утилизирует ГФ в качестве источника фосфора, что предполагает наличие ферментов, расщепляющих С—Р связь. Редкими исключениями являются мутантный штамм Arthrobacter sp. GLP-1/Nit, который использовал ГФ как источник азота [16], а также Streptomyces sp. StC [17] и Achromobacter sp. LW9 [18], способные использовать ГФ в качестве источника углерода. Известны два способа ферментативного расщепления ГФ у бактерий: "прямой" разрыв С—Р связи с образованием саркозина и неорганического фосфора (Pi) (рис. 1), и расщепление С—N связи с образованием глиоксилата и АМФК (рис. 2). В первом случае химически инертная С—Р связь разрывается сложно организованным многокомпонентным ферментным комплексом, известным как С—Р лиаза. Действие наиболее изученной С—Р лиазы Escherichia coli определяется продуктами 14 генов, организованных в phn-оперон. В составе С—Р лиазы различают компоненты, обеспечивающие транспорт фосфонатов внутрь клетки, регуляторные, вспомогательные компоненты, и собственно ферменты, катализирующие расщепление С—Р связи. Последние формируют, фактически, метаболический путь, контролирующий превращение интермедиа-тов как до, так и, возможно, после расщепления С—Р связи [19, 20]. В силу большой сложности С—Р лиазного комплекса и его необратимой инактивации при дезинтеграции клеток, механизм расщепления фосфонатов С—Р лиазой оставался загадкой в течение почти 30 лет. Первые представления о его возможной организации сформулированы лишь недавно [21, 22]. Согласно первым представлениям
о неспецифичности С—Р лиазы один и тот же муль-тиферментный комплекс расщеплял целый ряд ал-кил- и аминоалкилфосфонатов, включая ГФ, до P. и соответствующего (амино)углеродного остатка. Однако характер утилизации ГФ по С—Р лиазно-му пути у изученных штаммов-деструкторов заметно отличался от такового для прочих фосфо-натов. Это позволило предположить существование двух С—Р лиаз, одна из которых аналогична С—Р лиазе E. coli и специфична в отношении (амино)алкилфосфонатов но не ГФ, а другая расщепляет С—Р связь только у ГФ с образованием саркозина и P., причем обе системы индуцировались и функционировали независимо друг от друга. Впервые это было показано на примере Arthrobacter sp. GLP-1 [23], а затем наличие ГФ-специ-фичной С—Р лиазы, расщепляющей ГФ с образованием саркозина, было показано в работе [24] у Achromobacter sp. MPS 12A. По-видимому, существует более, чем 2 разновидности С—Р лиаз у бактерий. В геноме Pseudomonas stutzeri были найдены два разных оперона С—Р лиазы, определяющие разную субстратную специфичность, причем обе С—Р лиазы не разлагали ГФ [25].
Механизм расщепления ГФ по С—Р лиазному механизму все еще плохо охарактеризован как с биохимической, так и с молекулярно-биологиче-ской точки зрения и обсуждается лишь по аналогии с уже известными реакциями С—Р лиазного пути у E. coli [26]. Не выясненным, в частности, остается вопрос о происхождении столь узко специфичного для ГФ ферментного комплекса. Способность метаболизировать ГФ с образованием саркозина обнаруживалась в том числе и у бактерий, ранее никогда не контактировавших с этим соединением (табл. 1), что поднимает вопрос о
Накопление АМФК во внешней среде
Глифосат оксидоредуктаза
O
O"
I '/
HO-P-CH2-NH-CH2-C FAD
OH OH
Глифосат
Акцептор электрона (восстановленный)
Экскреция
O-
HO-P-CH2-NH
+
FADH
2
Акцептор электрона
OH
АМФК
С—Р лиаза
O O w о C-C
H OH
Гликоксилат
O- ,
HO-P-CH2-NH-CH2-Cf
O
Глифосат оксидоредуктаза
I
OH
OH
Pi + H3C-NH2t Метиламин
O-
ho-p-ch2-nh2 +
I
!2
ЕШ4
FADH
Глифосат
Акцептор электрона (восстановленный)
2
Акцептор электрона
OH
АМФК
O O w и C-C
H OH
Гликоксилат
^ Пируват Трансаминаза
- Аланин
O
0
1
HO-P~C4 OH H
Формилфосфонат
Фосфонатаза
H2O
pi + h-c;
.O
H
Дальнейший метаболизм
Формальдегид
Рис. 2. ГОР-путь метаболизма ГФ. 1 — путь, характерный для большинства изученных бактерий [33—36]; 2 — новый путь минерализации ГФ у О. аШкгор1 GPK 3 [24, 30].
существовании природных аналогов ГФ, которые могли бы служить субстратами для ГФ-специ-фичной С—Р лиазы.
Бактериальные штаммы, обладающие ГФ-спе-цифичной С—Р лиазой, обычно демонстрируют очень высокую эффективность деструкции гербицида в лабораторных условиях при росте на минеральных средах с ГФ в качестве единственного источника фосфора. Однако в природных экосистемах их биодеструктивные способности могут значительно снижаться, так как в подавляющем большинстве случаев экспрессия белков С—Р ли-
азного комплекса активируется лишь при дефиците внеклеточного Р; и узко специфичного фосфорном голодании клетки, что не характерно для природных сред [15, 16, 27].
Второй распространенный у бактерий путь катаболизма ГФ предполагает первичную атаку молекулы гербицида ферментом, известным как "глифосат-оксидоредуктаза" (ГОР) [28, 29]. Этот фермент, расщепляющий С—М связь в молекуле ГФ с образованием стехиометрических количеств АМФК и глиоксилата, был обнаружен нами у бактерий ОсктоЬа^гыт аМкгор1 ОРК 3, выделен и
+
2
Микроорганизмы-деструкторы ГФ с установленным таксономическим положением
Микроорганизм Источник выделения Первичный метаболит ГФ Грам-статус
Бактерии
Achromobacter sp. LW9 [18] Активный ил очистных сооружений АМФК -
Achromobacter sp. MPS 12A [24] Почва, загрязненная алкилфосфонатами Саркозин -
Agrobacterium radiobacter [60] Активный ил очистных сооружений Саркозин (предположительно) -
Alcaligenes sp. Gr* [32
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.