= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.57.065+57.022+57.012.4
МИКРОБНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ОБРАЗЦОВ ПОЗДНЕПЛЕЙСТОЦЕНОВЫХ МНОГОЛЕТНЕМЕРЗЛЫХ
ПОРОД СИБИРИ © 2013 г. Е. Б. Кудряшова*, Е. Ю. Черноусова**, Н. Е. Сузина*, ***,
Е. В. Арискина*, Д. А. Гиличинский
* Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино ** Воронежский государственный университет *** Пущинский государственный естественно-научный институт **** Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино
Поступила в редакцию 26.04.2012 г.
Метагеномное исследование образцов многолетнемерзлых пород Колымской низменности, возраст которых составляет 20—35 тыс. лет, проведенное с использованием набора "Geneclean for Ancient DNA kit" ("Bio101", США), выявило 8 филотипов, относящихся к филумам Actinobacteria и Proteobacteria. Анализ клоновой библиотеки генов 16S рРНК показал, что наибольшее количество клонов (48 и 29%) представлено родами Arthrobacter и Bradyrhizobium соответственно. Впервые обнаружены микроорганизмы родов Williamsia, Bradyrhizobium, Filomicrobium и Hansschlegelia в составе древних микробных сообществ данных экосистем. Анализ генов 16S рРНК изолятов выявил наличие среди них организмов -представителей филумов Firmicutes и Actinobacteria, как филогенетически близких к известным видам, так и явных представителей новых таксонов. Электронно-микроскопический анализ in situ тотальных препаратов изучаемых образцов показал наличие неповрежденных бактериальных клеток различных морфотипов.
Ключевые слова: многолетнемерзлые породы, метагеномный анализ, электронная микроскопия in situ, микроорганизмы, 16S рРНК.
DOI: 10.7868/S0026365613020080
Вечная мерзлота Земли разных возрастных периодов (от 6 тыс. до 3 млн. лет), является объектом изучения на протяжении длительного времени. Площадь распространения вечной мерзлоты только в Российской Федерации ~10.7 млн. км2, что составляет около 63% территории страны и большую часть Сибири [1]. Изучение биологического разнообразия, в том числе микробного, и выяснение структуры и функционирования микробных сообществ в многолетнемерзлых отложениях представляет интерес с точки зрения решения фундаментальных и практических задач. Первоначально работы по исследованию микробного разнообразия арктических многолетнемерзлых грунтов были направлены на изучение выделенных (культивируемых) микроорганизмов, а также на выявление in situ неповрежденных бактериальных клеток и их особенностей методами электронной микроскопии [2—4]. Применение моле-кулярно-генетических методов позволило существенно расширить представления об обитающих в вечной мерзлоте микроорганизмах. Впервые
1 Автор для корреспонденции (e-mail: katryn@ibpm.push-
chino.ru).
филогенетический анализ тотальной ДНК многолетнемерзлых древних грунтов Сибири использовали для характеристики архей [5]. Последующие исследования прокариотного мета-генома были выполнены на отдельных образцах, геологический возраст которых датировался от 100 тыс. до 2 млн. лет [6].
Целью настоящей работы было комплексное изучение микробного сообщества многолетне-мерзлых грунтов Сибири позднеплейстоценового периода (20—35 тыс. лет) методами анализа генов 16S рРНК метагенома образцов и выделенных в чистую культуру микроорганизмов, и электронной микроскопии in situ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Образцы многолетне-мерзлых пород были отобраны из скважины 4/09 с соблюдением правил асептики с различных глубин (4.4-4.6 м; 5.35-5.45; 7.1-7.2; 7.9-8.0; 8.78.8 и 9.2-9.4) в 2009 г. Отбор, хранение и транспортировку образцов осуществляли, как описано ранее [7].
Скважина расположена на водоразделе в среднем течении реки Большая Чукочья (69°29' с.ш.,
156°58' в.д.) Колымской низменности. Вскрытые скважиной породы представляли собой поздне-плейстоценовые синкриогенные отложения едом-ной свиты, возраст которых, согласно радиоуглеродным датировкам, 20—35 тыс. лет. Накопление отложений происходило одновременно с их промерзанием, и с момента своего формирования они никогда не оттаивали.
Выделение ДНК. Выделение тотальной ДНК проводили из суммарного образца (полученного после объединения и тщательного перемешивания образцов с разных глубин скважины, с соблюдением правил асептики) с использованием набора "Geneclean for Ancient DNA kit" ("Bio101", США) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.
Для выделения ДНК из чистых культур микроорганизмов проводили три чередующихся цикла замораживания (—70°С), оттаивания (55°С) и последующего нагревания суспензии клеток в течение 20 мин при 85°С [8]. ДНК выделяли феноль-ным методом [9].
Амплификацию фрагментов генов 16S рРНК
проводили с использованием универсальных бактериальных праймеров 27F (5'-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3') и 1492R (5'-TACGGYTACCT-TGTTACGACTT-3') на приборе GeneAmp PCR System 2700 ("Applied Biosystems", США).
Клонирование генов 16S рРНК. Амплифициро-ванные фрагменты генов 16S рРНК клонировали в векторе pGEM-T с использованием набора реактивов pGEM-T Easy Vector Systems ("Promega", США) в соответствии с протоколом производителя. Скрининг клоновой библиотеки начинали с амплификации клонированных генов 16S рРНК с праймерами T7F (5'-TAATACGACTCACTATA-3') и Sp6R (5'-TATTTAGGTGACACTATAG-3'), специфичными соответствующим промоторным участкам плазмиды, и последующей реамплифи-кацией полученной вставки с бактериальными праймерами 27F и 1492R.
Рестрикционный анализ (ARDRA) полученных клонов проводили с использованием эндонуклеаз HhaI и HaeIII для выявления групп (филотипов), несущих сходные фрагменты ДНК [10]. Из каждого филотипа отбирали случайным образом по одному клону для дальнейшего анализа последовательностей генов 16S рРНК.
Определение нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США) в соответствии с протоколом, предлагаемым фирмой. Последовательности генов 16S рРНК клонов и изолятов депонированы в GenBank под номерами: JN251890; JN251891; JN251892; JN251893; JN251894; JN251895; JN936296; JN936297; JN936298; JQ742086; JQ742087; JN967759; JN967760; JN967761; JN967762; JN967758; JQ754140.
Выявление возможных химерных структур ДНК
проводили с помощью программы on-line Bellerophon v3 (http://greengenes.lbl.gov). Один из филотипов (PF-3), идентифицированный как возможная химера, был исключен из дальнейшего анализа.
Филогенетический анализ. Выявление близкородственных организмов проводили с использованием баз данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и веб-ресурса EzTaxon (http://eztaxon-e.ezbio-cloud.net/ ). Последовательности были выровнены с помощью веб-ресурса RDP (http://rdp.cme.msu.edu) [11]. Филогенетический анализ и построение дерева проводили с помощью программы MEGA версия 5 [12].
Выделение чистых культур микроорганизмов проводили после предварительного низкотемпературного отмывания и концентрирования клеток из образцов с целью уменьшения воздействия колебаний температуры на клетки и освобождения их от частиц грунта. В пробирку с исследуемым образцом грунта (1 г) добавляли охлажденный до 4°С раствор (9 мл), содержащий 0.85% NaCl и реактивирующие факторы (0.1% пируват натрия [13], 0.1% пирофосфат, 0.05% пирролохи-нолинхинон (PQQ) [14], 4 мкг/мл L-a-фосфати-дил^-серин из сои (PS) [15]). Смесь диспергировали на вортексе (1—2 мин), частицы грунта отделяли декантированием, поместив пробирку в емкость со льдом на 5—7 мин, затем отбирали на-досадочную часть в другую пробирку. К осадку снова добавляли охлажденный раствор, этапы отмывания повторяли, данную процедуру для осадка проводили с двукратной повторностью с соблюдением правил асептики. Надосадочную часть, содержащую отмытые клетки, суммировали. Аликвоты суммарной надосадочной части высевали на: 1) среду R2A, пятикратно разведенную с добавлением 0.67 мл/л 0.05% раствора PQQ; 2) среду R2A, пятикратно разведенную с 10 мл/л 0.1% раствора АМФ (аденозин цикло монофосфата) [16]; 3) среду R2A с 0.67 мл/л 0.05% раствора PQQ, 10 мл/л 0.1% раствора АМФ, 1.0 мл/л раствора PS в концентрации 4 мкг/мл; 4) питательный агар BBL, десятикратно разведенный с 0.67 мл/л 0.05% раствора PQQ, 1.0 мл/л раствора PS в концентрации 4 мкг/мл. Инкубировали при 24 и 4°С в течение 30, 60 сут и более.
Электронная микроскопия. Каплю из суммарной надосадочной части, полученной, как описано выше, наносили на поверхность медной сеточки, покрытой формваровой подложкой, удаляли избыток жидкости, высушивали и просматривали в электронном микроскопе без дополнительного контрастирования. Приготовление ультратонких срезов содержимого осадка, полученного путем центрифугирования суммарной надосадочной части (3 мин при 14.5 тыс. об./мин), проводили по методу, описанному ранее [17]. Тотальные препараты и ультратонкие срезы просматривали в элек-
тронном микроскопе JEM-100B ("JEOL", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Для определения выявляемых в тотальных препаратах объектов как клеток микроорганизмов, использовали накопленный опыт в области изучения различных морфотипов бактериальных клеток и разработанные критерии отличия клеток микроорганизмов от абиогенных клеткопо-добных частиц [18].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Созданная клоновая библиотека по гену 16S рРНК из суммарного образца многолетнемерз-лой породы, датируемой поздним плейстоценом (20—35 тыс. лет), включала 30 клонов. Рестрикци-онный анализа (ARDRA) клонов выявил наличие 9 филотипов. Идентификация клонов была проведена на основе анализа фрагментов генов 16S рРНК длинной около 600—800 п.н. — в большинстве случаев достаточной, как показывает опыт, для установления таксономического положения организма на уровне рода. Уровень сходства фрагментов 95% условно считали пороговым при решении вопроса о принадлежности представителей филотипов к тому или иному роду [19].
Таксономический состав клоновой библиотеки генов 16S рРНК микробного сообщества. Филогенетический анализ амплифицированных нуклео-тидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК полученных клонов показал их принадлежность к филумам Actinobacteria и Proteobac-ter
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.