БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2014, № 2, с. 40-46
^ ВОДНАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.26.266
МИКРОБНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗОРАЗЛАГАЮЩЕГО СООБЩЕСТВА ПЕСЧАНОГО МАТА ОЗЕРА ЗУН-ТОРЕЙ (ЮЖНОЕ ЗАБАЙКАЛЬЕ)
© 2014 г. Л. П. Козырева*, Д. В. Егорова*, Л. Н. Ананьина**, Е. Г. Плотникова**, Б. Б. Намсараев*
*Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения РАН, 670047г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, e-mail: l-kozyr@mail.ru **Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, 614081 г. Пермь, ул. Голева, 13 Поступила в редакцию 30.01.2013 г.
Изучено разнообразие микробного сообщества накопительных культур песчаного мата содового оз. Зун-Торей (Забайкалье). Использование классических микробиологических и молекулярно-ге-нетических методов позволило оценить численность и охарактеризовать разнообразие бактерий — деструкторов целлюлозоразлагающего сообщества разных горизонтов песчаного мата.
Ключевые слова: содовое озеро, песчаный мат, таксономическое разнообразие, денатурирующий градиентный гель-электрофорез, ген 16S рРНК.
Б01: 10.7868/80320965214020077
ВВЕДЕНИЕ
Прибрежная полоса озер — экотонная зона между сушей и водоемом, где наблюдаются активные микробные процессы под влиянием изменяющихся условий среды. Обнаруживаемые в таких местах микробные маты и биопленки участвуют в процессе фотосинтеза, трансформации и переноса питательных веществ в биогеохимических циклах. В морских экосистемах взаимодействие между микробными и физическими процессами играет важную роль в образовании осадочных структур [7].
В прибрежной песчанистой полосе некоторых содовых и соленых озер обнаруживаются так называемые песчаные маты, которые стабилизируют структуру песка и представляют значительный интерес с точки зрения изучения их структуры и функционирования. Песчаные маты обнаружены в береговой зоне слабоминерализованных озер Забайкалья Барун-Торей и Зун-Торей, входящих в систему Торейских озер, которые считаются остатками древнего моря, существовавшего здесь 150—80 млн лет назад. Визуальные наблюдения и микроскопические исследования показывают, что структурообразующие организмы в таких образованиях — нитчатые цианобактерии. Присутствие клеток цианобактерий, а также остатков высшей растительности, привносимых с берегов, дает основание предполагать, что основной ком-
понент органического вещества песчаного мата — целлюлоза.
Цель работы — изучение количественного распределения и таксономического разнообразия целлюлозоразлагающих и сбраживающих бактерий в песчаном мате содового оз. Зун-Торей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Озера Зун-Торей и Барун-Торей — крупнейшие озера Забайкалья. Зун-Торей — бессточное содовое озеро, принимающее воду из небольших степных речек Ималки и Улдзы. Озерные воды содержат большое количество растворенных солей (гидрокарбонаты, хлориды и др.), привносимых речными водами. Минерализация воды колеблется от 1 г/дм3 при высоких уровнях воды до 10 г/дм3 — при низких. Площадь водного зеркала в годы повышенной водности достигает 300 км2. Наибольшая глубина 7 м. Озеро Зун-Торей соединяется протокой с оз. Барун-Торей и имеет примерно одинаковый с ним водный режим. Из двух озер Зун-Торей служит приемником и накопителем солей. В засушливые годы оно почти полностью высыхает. На дне остаются лишь мелкие разобщенные озерца. Вода мутная. Прозрачность ~5—10 см [4, 5].
В период исследований (сентябрь 2009 г.) рН воды была 9.49, рН водной вытяжки мата
МИКРОБНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗОРАЗЛАГАЮЩЕГО СООБЩЕСТВА 41
9.23—9.68, содержание CO3 600 мг/дм3 и HCO-
1900 мг/дм3, минерализация 5.7 г/дм3 [3]. Для исследования взята колонка песчаного мата высотой 7 см, отобранного в прибрежной части озера.
В колонке песчаного мата методом предельных разведений определяли численность аэробных и анаэробных бактерий — деструкторов целлюлозы (как первичных деструкторов органического вещества) и сбраживающих бактерий (как группы, осуществляющей переход к конечным этапам деструкции). Посевы выполняли в жидкой минеральной среде, состоящей из KH2PO4 — 0.2, MgCl2 • 6H2O - 0.1, NH4Cl - 0.5, KCl - 0.2, дрожжевой экстракт — 0.01 г/л. В качестве субстратов вносили для целлюлолитиков полоску фильтровальной бумаги 0.5 см х 10 см, для бактерий-бро-дильщиков — глюкозу (4 г/л). Значения рН и минерализации, соответствующие гидрохимии озера, устанавливали с помощью 10%-ных стерильных растворов NaHCO3, Na2CO3 и NaCl. Посевы инкубировали в термостате при температуре 30°С. Культивирование в аэробных условиях проводили в пробирках, заполненных средой на 1/3 высоты под ватной пробкой. Анаэробные условия создавали, наполняя пробирку средой доверху, и культивировали под резиновой пробкой.
Для исследования накопительных культур аэробных и анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий (ЦРБ) использованы варианты культивирования бактерий, где наблюдалось наилучшее разложение полоски фильтровальной бумаги. Культивирование проводили в течение 2 нед в термостате при температуре 30°С, затем — 2 нед при комнатной температуре на свету. Накопительную культуру бактерий-бродильщиков изучали после недельного культивирования при условиях, описанных выше.
Морфологическое разнообразие клеток в накопительных культурах изучали с использованием светового микроскопа AxioStar plus ("CarlZeiss", Германия), оснащенного фотодокументирующей системой Axiovision и фазово-контрастной приставкой (х1000).
ДНК из накопительных культур ЦРБ и бакте-рий-бродильщиков выделяли, используя коммерческий набор "ДНК-сорб" ("AmpliSens biotechnologies", Россия) в соответствии с протоколом фирмы-производителя, из 100 мкл культуральной жидкости, которую перед отбором пробы тщательно встряхивали.
Для характеристики таксономического состава накопительных культур применяли денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) — метод, основанный на разделении амплифициро-ванных фрагментов гена 16S рРНК бактерий в химическом денатурирующем градиенте. Фрагмент гена 16S рРНК амплифицировали с прай-
мерами: 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'), включающим 40 п.н. GC-хвост (5'-CGCCCGCCGC GCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3') на 5'-конце, и 518R (5'-ATTACCGCGGCT-GCTGG-3') [14]. Амплификацию проводили в термоциклере My Cycler ("Bio-Rad Laboratories", США), ДГГЭ — на приборе Dcode™ Universal Mutation System ("Bio-Rad Laboratories", США) при условиях, описанных ранее [1]. Визуализацию в проходящем УФ-свете и документирование геля осуществляли на приборе Gel Doc XR ("BioRad Laboratories", США) после окрашивания геля в растворе бромистого этидия (0.5 мкг/мл).
Расчет коэффициента сходства между образцами накопительных культур и построение денд-рограммы методом невзвешенного парногруппо-вого метода (UPGMA) осуществляли с использованием пакета программ TreeconW вер. 1.3. [15], при этом считали, что количество полос на форе-грамме соответствует числу операциональных таксономических единиц (ОТЕ).
Для филогенетического анализа фрагментов гена 16S рРНК полосы ДГГЭ-профиля с высокой интенсивностью свечения в УФ-свете вырезали из гелевой пластины и помещали в стерильные эппендорфы с 100 мкл деионизированной воды. Полученные растворы выдерживали 1 ч при комнатной температуре, затем из эппендорфов отбирали 95 мкл жидкости и повторно вносили 10 мкл свежей деионизированной воды и экстрагировали ДНК из геля в течение ночи при температуре 4°С. Для реамплификации фрагмента гена 16S рРНК использовали 1 мкл полученного раствора. Нуклеотидные последовательности реамплифи-цированных фрагментов 16S рДНК определяли на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 3500xl ("Applied Biosystems", США) в соответствии с рекомендациями производителя и выравнивали с использованием программы CLUSTAL W [13]. Для их филогенетического анализа применяли программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и Ez-Taxon 2.1 (http://www.eztaxon.org).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В колонке песчаного мата при послойном посеве численность аэробных и анаэробных целлю-лозоразлагающих бактерий (ЦРБ) варьировала от 100 тыс. до 100 млн кл./см3, при этом численность анаэробных ЦРБ была выше на 1—3 порядка. К нижним слоям отмечено уменьшение численности аэробных и анаэробных ЦРБ на порядок. Численность бродильщиков составляла 10 тыс. — 10 млн кл./см3; отмечена тенденция к ее увеличению с глубиной. Численности целлюлозоразлага-ющих и сбраживающих бактерий не коррелировали с количеством органического вещества (рис. 1).
42
КОЗЫРЕВА и др.
стридиального и бациллярного типов, а также отдельные споры отмечены только в анаэробных условиях. Клетки микроорганизмов образовывали скопления на волокнах целлюлозы и присутствовали в культуральной жидкости. В аэробных условиях в накопительной культуре из поверхностного слоя, а также слоя 3—5 см наблюдалось развитие нитчатых цианобактерий.
Изучение таксономического состава накопительных культур целлюлолитиков и бродильщи-ков методом ДГГЭ выявило ряд закономерностей. Для сообществ бактерий-бродильщиков зафиксировано увеличение количества ОТЕ по горизонту, при этом, несмотря на изменение таксономического состава, в сообществах сохранялся одинаковый доминирующий филотип (рис. 3а). В накопительных культурах ЦРБ образцов горизонта 3—5 см отмечено увеличение количества ОТЕ и выявлено изменение состава (уровень сходства ДГГЭ-профилей был низким — <57.2%) по сравнению с накопительными культурами образцов поверхностного слоя. Полученные результаты показывают, что отобранные пробы нижних слоев песчаного мата обладают наибольшим разнообразием и отличаются от проб поверхностных слоев таксономическим составом. Следует отметить, что доступность кислорода в накопительных культурах ЦРБ влияла на состав сообществ. Так, максимальный уровень сходства ДГГЭ-профилей аэробных и анаэробных сообществ ЦРБ одного горизонта <66.7% (рис. 3а, 3б). Аэробные и анаэробные сообщества ЦРБ одного горизонта характеризовались разными доминирующими филотипами, а наличие в сообществах аэробных и анаэробных ЦРБ разных горизонтов
Рис. 2. Морфологическое разнообразие клеток в накопительных культурах (н.к.) ЦРБ. Аэробная н.к.: а, б — поверхностный слой, в—ж — слой 3—5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.