МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 6, с. 722-729
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 579.266
МИКРОБНОЕ СООБЩЕСТВО ДОННЫХ ОСАДКОВ СОЛОНОВАТОГО ЩЕЛОЧНОГО ОЗЕРА БЕЛОЕ (ЗАБАЙКАЛЬЕ)
© 2014 г. С. В. Зайцева*, Е. Ю. Абидуева*, Б. Б. Намсараев*, Л. Ванг**, Л. Ву**
*Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ **Университет Внутренней Монголии, Хуххото, Внутренняя Монголия, Китай Поступила в редакцию 03.06.2014 г.
Совместные исследования таксономического разнообразия микроорганизмов и определение интенсивности микробных процессов продукции и деструкции органического вещества позволили сделать вывод о значительном разнообразии и активности микроорганизмов цикла серы в микробном сообществе поверхностного слоя осадков озера Белое (рН 9.4, минерализация 3.1 г/л). Особенностью филогенетического разнообразия микробного сообщества на основе данных пиросеквени-рования гена 168 рРНК является численное доминирование и разнообразие последовательностей бактерий, участвующих в образовании и окислении Н2. Доминирующие в сообществе бактерии рода Hydrogenophaga являются аэробными и факультативно-анаэробными хемооргано- и хемолитоав-тотрофами, которые используют окисление водорода для получения энергии и играют важную роль в транзитных зонах смешения подземных и поверхностных вод.
Ключевые слова: пиросеквенирование, щелочное озеро, Hydrogenophaga.
DOI: 10.7868/S0026365614060226
Активное применение молекулярных методов в исследованиях филогенетического разнообразия микробных сообществ природных экосистем значительно реформировало систему данных о таксономическом и функциональном разнообразии микробиоты [1, 2]. Определение доминирующих и минорных компонентов микробных сообществ, ставшее доступным благодаря пиросеквенирова-нию, позволяет определить и дополнить данные о структуре микробного сообщества, понять, как микробное сообщество работает, развивается и осуществляет биогеохимические циклы [3].
Щелочные озера являются экстремальными водными системами, которые характеризуют высокие значения рН 9—11, преобладание в ионном составе карбонатов и широкий диапазон минерализации, от солоноватых до гиперсоленых [4]. Функционально микробные сообщества содовых озер достаточно хорошо изучены, в настоящее время получена полноценная трофическая и функциональная схема основных биогеохимических циклов с выделением в чистые культуры представителей трофических групп [5—9]. В то же время, более полное метаболическое и филогенетическое разнообразие микробных сообществ воды и осадков содовых озер возможно оценить используя методы молекулярной биологии [10—12].
1 Автор для корреспонденции (e-mail: svet_zait@mail.ru).
Методом пиросеквенирования были проанализированы поверхностные осадки (0—5 см) из ряда щелочных озер Тибетского плато в градиенте солености от 0.32 до 308.0 г/л [13].
Озеро Белое является достаточно хорошо изученным водоемом и представляет собой типичное для территории Забайкалья мелководное, слабоминерализованное щелочное озеро с сезонными колебаниями уровня воды, температуры, рН и минерализации. Ранее было показано, что функционирование микробного сообщества оз. Белое определяется целым рядом физико-химических параметров и их сезонными изменениями [14, 15]. Из воды озера выделены культуры органо-трофных бактерий с нейтрофильными и галоал-калофильными свойствами [16].
Целью данного исследования является оценка филогенетического и метаболического разнообразия микробного сообщества в поверхностных осадках слабоминерализованного щелочного озера Белое.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Слабоминерализованное щелочное озеро Белое располагается в Оронгойской впадине долины р. Селенга, в 47 км к юго-востоку от г. Улан-Удэ (Республика Бурятия) (51°32'40'' N 107°02'42'' Е). Наибольшая площадь озера состав-
ляет 0.63 км2, максимальная глубина 2.1 м. В прибрежной части озера находится выход щелочного минерального источника (рН 8.7). Отбор проб поверхностных осадков озера Белое был проведен летом 2012 г. Пробы ила (0—0.5 см) были отобраны стерильным шпателем в стерильную посуду и сразу же помещены в холодильник с температурой 5—6°C. Температуру, рН и минерализацию определяли портативными полевыми приборами. Скорости микробных процессов определяли радиоизотопным методом, как описывали ранее [15].
Пиросеквенирование. Препарат ДНК выделяли из 0.5 г осадка по методу, включающему механическую обработку образца с помощью гомогенизации со стеклянными шариками и последующим удалением гуминовых кислот и лизисом клеточной стенки с помощью SDS [17]. Три экстракции ДНК из каждого образца осадка были объединены вместе, чтобы уменьшить смещение, вызванное неоднородностью пробы. Препараты ДНК хранили при —80°C до последующего использования.
Универсальные бактериальные праймеры 27F (5'—3' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 533R (5'—3' TTACCGCGGCTGCTGGCAC, фланкирующие гипервариабельные участки гена 16S рРНК — V1 (позиции 66—69 на 16S рДНК) и V3 (позиции 433—497), были синтезированы "Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd." (Шанхай, КНР). Амплификация, проводимая на термоцик-лере ABI 9700 ("ABI", Foster City, США), включала начальную денатурацию при 95°C в течение 2 мин, 25 циклов при 95°C в течение 30 с, 30 с при 55°C, 30 с при 72°C и заключительный этап при 72°C в течение 5 мин. Продукты ПЦР реакции очищали наборами AxyPrep DNA Gel Extraction Kit ("Axygen", США). Пиросеквенирование проводили согласно инструкциям производителя для пиросеквенирования ампликонов на пиросекве-наторе Roche/454 Genome Sequencer FLX Titanium.
Данные обрабатывали, используя систему mothur [18]. Валидные последовательности были обработаны UCHIME, а затем в соответствие с алгоритмом Needleman и сгруппированы в бактериальной базе SILVA [19], кластеризацию в ОТЕ проводили с использованием программ mothur и chopseq (Majorbio) (http://www.majorbio.com). Таксономическое разнообразие сообщества оценивали при уровнях различий, соответствующих следующим таксонам: вид — 0.03 (97%), род — 0.05 (95%), семейство — 0.1 (90%). Классификацию видов проводили на основе генотипического подхода в соответствии с международным кодом номенклатуры бактерий (ICNB). Кластер относили к соответствующему виду при гомологии более 97% с последовательностью валидированного микроорганизма.
Таблица 1. Индексы видового богатства и разнообразия на разных уровнях кластерного расстояния
Дистанция ACE ^ao Индекс Шеннона Индекс Симпсона
0.03 6985 5173 6.67 0.005
0.05 5119 3981 6.32 0.008
0.10 2825 2357 5.73 0.015
Индексы видового обилия и разнообразия сообществ рассчитывали с использованием программы mothur:
Chao — the Chaol estimator (http://www. mothur.org/wiki/Chao),
Ace — the ACE estimator (http://www. mothur.org/wiki/Ace),
Индекс Шеннона (http://www.mothur.org/wiki/ Shannon),
Индекс Симпсона (http://www.mothur.org/wi-ki/Simpson).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Температура в месте отбора пробы составляла 20.5°C, рН 9.4, минерализация придонной воды была 3.1 г/л.
Разнообразие микробного сообщества поверхностного слоя осадков озера Белое. В пробе поверхностного осадка прибрежной зоны озера Белое в результате пиросеквенирования было обнаружено 12190 последовательностей гена 16S рРНК. Микробное сообщество было достаточно разнообразным, в его составе было выявлено 2684 филотипа (ОТЕ), которые принадлежали 38 филам. Кривая накопления видов не выходила на плато, число выявленных ОТЕ увеличивалось линейно (рис. 1). Видовое богатство (при кластерном расстоянии 0.03) оценивалось по непараметрическим критериям ACE и Chao1 и составляло 6985 и 5173. Индекс видового разнообразия Шеннона на уровне вида был 6.67, индекс Симпсона — 0.005 (табл. 1).
По количеству последовательностей и родов доминировали филы: Proteobacteria (52.98%), Bacteroidetes (18.40%) и Firmicutes (6.35%). Расчеты здесь и далее сделаны за вычетом неклассифицированных последовательностей.
Более половины определенных последовательностей относятся к филе Proteobacteria, представленной преимущественно Betaproteobacteria (32.5%) и Deltaproteobacteria (11.0%).
Самый многочисленный среди протеобактерий класс Betaproteobacteria (32.5%) характеризовался преобладанием некультивируемых представителей двух родов: Hydrogenophaga (14.4%), водородо-кисляющими факультативными хемолитоавтотро-фами, и сероокисляющими Thiobacillus (12.4%).
Последовательности
Рис. 1. Оценка разнообразия бактериального сообщества: кривые накопления видов на различных уровнях кластерного анализа (0.03, 0.05 и 0.1).
Род Hydrogenophaga (class Betaproteobacteria, order Burkholderiales, family Comamonadaceae) объединяет хемооргано- и хемолитоавтотрофные бактерии, использующие окисление водорода для получения энергии [20]. Известно, что виды рода Hydrogenophaga являются аэробными или факультативно-анаэробными бактериями, способными окислять водород только в случае недоступности органического углерода, т.е. они относятся к факультативным автотрофам [21]. Современные данные позволяют определить важную роль этих микроорганизмов в транзитных зонах, где обогащенные водородом, ультраосновные подземные воды смешиваются с кислородсодержащими поверхностными водами и рассматривают этот род как индикаторов глубинных геохимических процессов образования водорода.
Интересно, что бактерии, близкие к Hydrogenophaga, доминировали в микробных сообществах поверхностных вод сильнощелочных (рН до 11.5), слабоминерализованных источниках Цедар (США, Калифорния) [22], хотя, в глубинных водах Цедар преобладали другие представители Betaproteobacteria — новый род Serpentinomonas [23]. Последовательности 16S рРНК, близкие к Hydrogenophaga, преобладали в метагеноме ультраосновных источников Тейбллэндс (Канада), с экстремальными значениями рН 10—12 [21, 24]. Сравнительное обилие бактерий Hydrogenophaga в метагеноме ультраосновных источников коррелировало с высокими значениями рН и низким окислительно-восстановительным потенциалом, но не имело корреляции с содержанием Н2 и СН4. Метагеномные данные, ассоциированные с Hydrogenophaga, включали гены, кодирующие фермен-
ты, которые участвуют в фиксации угле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.