УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2014, том 134, № 2, с. 111-120
УДК 581.526.44:579+579.61
МИКРОБНОЕ СООБЩЕСТВО ЭПИФИТОНА ВОДОХРАНИЛИЩА: РОЛЬ ВИРУСОВ В СМЕРТНОСТИ ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ
И ПИКОЦИАНОБАКТЕРИЙ
© 2014г. А. И. Копылов, Д. Б. Косолапое, И. В. Рыбакова, Е.А. Заботкина
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, Борок, Ярославская обл.
E-mail: kopylov@ibiw.yaroslavl.ru
Определена численность и биомасса основных компонентов микробного сообщества (вирусов, гетеротрофных бактерий и жгутиконосцев, пикоцианобактерий, амеб и микроскопических грибов) в обрастаниях шести массовых видов высших водных растений Рыбинского водохранилища. Оценена роль вирусов в смертности прокариотных микроорганизмов. Общая биомасса эпи-фитных микробных сообществ на разных растениях изменялась в пределах 0.152-2.298 мкг С/ см2. Наиболее многочисленным компонентом микробного сообщества были вирусы ((17-106) х х 106 частиц/см2). Количество гетеротрофных бактерий ((1.7-43.1) х 106 кл/см2) было в 1.6-9.6 раза ниже численности вириоэпифитона, но их биомасса (0.082-1.760 мкг С/см2) занимала основную часть (51.9-88.3%) общей биомассы микробного сообщества. Инфицированные вирусами клетки составляли в среднем 5.3% и 2.7% численности гетеротрофных бактерий и пикоцианобактерий соответственно. Это существенно ниже значений этих параметров в воде зарослей макрофитов, где они составляли 19.3% и 7.6% соответственно. Вирусы играли незначительную роль в контроле численности и продукции эпифитных прокариотов. Доля лизогенных бактерий в бактериоэпифи-тоне составляла 0-16.9%.
Ключевые слова: эпифитон, микробное сообщество, вирусы, равнинное водохранилище.
ВВЕДЕНИЕ
Перифитон - сообщество гидробионтов (водорослей, цианобактерий, гетеротрофных бактерий, грибов и животных), существующих в прикрепленном к субстрату состоянии, - неотъемлемый структурный и функциональный компонент пресноводных экосистем (Протасов, 1994). Особенно велика его роль в потоках вещества и энергии в мелководных озерах и водохранилищах, а также прудах и реках. Вклад перифитона в общую годовую первичную продукцию фитопланктона, макрофитов и перифитона североамериканских и европейских озер изменяется в зависимости от их морфометрических и продукционных характеристик в широких пределах: от 1 до 92% (УаёеЪопсоеиг, Steinman, 2002). Перифитон, развивающийся на макрофитах, называют эпифито-ном. В водохранилищах Верхней Волги основным субстратом для обрастаний служат высшие водные растения, заросли которых в настоящее время занимают 4% площади Рыбинского и 29% площади Иваньковского водохранилищ (В.Г. Пап-
ченков, личное сообщение). В последние годы в этих водохранилищах наблюдается увеличение как площади зарастания, так и биомассы макрофитов (Пырина, Ляшенко, 2005). Соответственно возрастает и роль эпифитона в функционировании экосистем волжских водохранилищ, что делает изучение этого сообщества особенно актуальным.
Исследования эпифитона в основном связаны с определением видового состава, биомассы и продукции водорослей и крупных цианобактерий (Макаревич, 1985; Lalonde, Downing, 1991; Си-гарева и др., 2001; Жукова, 2005), а эпифитные бактерии, простейшие и особенно вирусы изучены в гораздо меньшей степени (Baker, Orr, 1986; Farnell-Jackson, Ward, 2003; Рыбакова, 2010). Немногочисленные проведенные исследования обнаружили в обрастаниях макрофитов высокое количество вирусов, что предполагает их значительное влияние на микроорганизмы. Однако в эпифитоне Phragmites australis при высокой численности вирусов не было обнаружено инфицированных клеток бактерий (Filippini et al., 2006).
Цель работы - определить количество и продукцию основных компонентов микробных сообществ в обрастаниях массовых видов высших водных растений Рыбинского водохранилища и оценить роль вирусов как фактора, контролирующего развитие эпифитных гетеротрофных бактерий и пикоцианобактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материал для исследования был собран в прибрежно-мелководной зоне Рыбинского водохранилища 12 сентября 2011 г. Глубина воды в местах отбора проб составляла 0.7-1.0 м, температура - 17.0-17.5 оС. Изучали эпифитные микробные сообщества шести видов высших водных растений: рогоза широколиственного (Typha lati-folia L.), урути колосистой (Myriophyllum spicatum L.), телореза обыкновенного (Stratiotes aloides L.), кувшинки белой (Nymphaea alba L.), рдеста пронзеннолистного (Potamogeton perfoliatus L.) и тростника обыкновенного (Phragmites communis Trin.). Обрастания смывали с растений и разбавляли стерильной природной водой, предварительно профильтрованной через фильтр с диаметром пор 0.02 мкм. Образцы обрастаний и воды, отобранной в зарослях макрофитов, фиксировали глу-таральдегидом до конечной концентрации 2%, хранили в темноте при температуре 4 оС и обрабатывали в течение двух недель.
Вирусные частицы учитывали методом эпифлу-оресцентной микроскопии с применением красителя SYBR Green I и фильтров из оксида алюминия Anodisc ("Wathman") с диаметром пор 0.02 мкм (Noble, Fuhrman, 1998), гетеротрофные бактерии и жгутиконосцы - с использованием флуорохромов DAPI и примулина и черных ядерных фильтров с диаметром пор 0.2 и 0.5 мкм соответственно (Porter, Feig, 1980; Caron, 1983). Количество и размеры пикофототрофов, к которым относили одиночных цианобактерий и водорослей размером менее 2.5 мкм, определяли с помощью эпифлуоресцент-ной микроскопии по автофлуоресценции фито-пигментов, содержащихся внутри их клеток (Ma-clsaac, Stockner, 1993). Отдельно считали делящиеся микробные клетки. Численность и размеры микроскопических грибов определяли методом эпифлуоресцентной микроскопии с использованием флуорохрома калькофлуора белого (Терехова, 1991). Препараты просматривали при увеличении в 1000 раз под эпифлуоресцентным микроскопом Olympus BX51 (Япония) с системой анализа изображений. Содержание углерода в сырой биомассе бактерий (С, фг С/кл) рассчитывали согласно ал-
лометрическому уравнению: С = 120 х V072, где V - объем клетки, мкм3 (Norland, 1993). Биомассу пикофототрофов и более крупного фитопланктона пересчитывали на углерод, допуская, что углерод составляет соответственно 16.5% и 10% их сырой биомассы (Jochem, 1988). Содержание углерода в 1 вирусной частице принимали равным 0.2 фг (Wilhelm, Smith, 2000). Допускали, что углерод составляет 22% сырой биомассы гетеротрофных флагеллят (Borsheim, Bratbak, 1987). Для пересчета сырой биомассы микроскопических грибов на углерод использовали коэффициент, равный 250 фг С х мкм-3 (Newell, Statzell-Tallman, 1982).
Для определения частоты отчетливо видимых инфицированных вирусами гетеротрофных и ав-тотрофных микроорганизмов (Frequency of visibly infected cells (FVIC), % общего количества бактерий) и среднего количества зрелых фагов в инфицированных бактериях (Burst size (BS), частиц/кл) применяли метод просвечивающей электронной микроскопии. Вирусы и бактерии осаждали центрифугированием при 100000 g (35000 об/мин) в течение 1 ч с использованием ультрацентрифуги OPTIMA L-90k ("Beckman Coulter", США) на никелевые сеточки плотностью 400 мешей, покрытые пиолоформом с угольным напылением. Препараты просматривали в электронном микроскопе JEM 1100 ("Jeol", Япония) при увеличении 50000-150000 раз (Копылов и др., 2010).
Для определения доли инфицированных клеток в сообществе гетеротрофных бактерий (Frequency of infected cells (FIC), % общей численности бактерий) использовали уравнение FIC = 7.1 х х FVIC - 22.5 х FVIC2 (Binder, 1999). Для расчета этого параметра у пикофототрофов принимали, что эклипс-фаза в латентном периоде вирусов пикоцианобактерий составляет 0.75 (Suttle, 2000; Mann, 2003).
Смертность бактерий, вызванную вирусным лизисом (viral-mediated mortality of bacteria (VMB), %), определяли расчетным путем (Binder, 1999; Mann, 2003). При этом допускали, что инфицированные и неинфицированные бактерии выедаются консументами с одинаковой скоростью, и что латентный период равен времени генерации бактерий (Proctor et al., 1993). Полагали также, что численность бактерий остается постоянной, т.е. продукция бактерий равна их смертности. Скорость вирусного лизиса гетеротрофных бактерий и пикоцианобактерий (virus-induced mortality (VIM), кл/(мл х ч)) рассчитывали по уравнению: VIM = VMB х p, где P - продукция микроорганизмов, кл/(мл х ч).
Продукцию вирусов (PV) определяли как произведение BS и VIM. Скорость поступления в окружающую водную среду легкоусвояемых органических веществ из клеток микроорганизмов, лизированных вирусами, находили по разнице VIM и PV, выраженных в мкг С/(м3 х сут). Полученные в результате этих расчетов значения являются завышенными, поскольку не учитывают энергетические траты вирусов на синтез белков капсидов и процессы репликации нуклеиновых кислот из-за отсутствия таковых в литературе.
Количество лизогенных бактерий (NBL), т.е. бактерий, в клетках которых находились профа-ги, определяли с использованием митомицина С (Paul, Jiang, 2001). Время инкубации опытных (с митомицином) и контрольных (без митомицина) проб составляло 24 ч. Количество лизогенных бактерий рассчитывали следующим образом: Nbl = (NMC - NC)/BS, где NMC - численность вирусов в опытах с добавлением митомицина, NC -численность вирусов в контроле, BS - количество зрелых фагов в бактериальной клетке.
Продукцию бактериопланктона измеряли по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток с использованием пересчетного коэффициента, равного 2.15 х 1018 кл/моль (Smits, Riemann, 1988).
Для оценки удельной скорости роста (ц) пикоцианобактерий использовали следующее уравнение: ц = (1/td) ln(1 + f), где td - продолжительность деления клетки, f - частота делящихся клеток (McDuff, Chisholm, 1982). Принимали, что td пикоцианобактерий составляет в среднем 3 ч (Carpenter, Campbell, 1988). Продукцию пико-цианобактерий определяли как произведение их удельной скорости роста и биомассы.
При установлении взаимосвязей между параметрами использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмена для уровня значимости 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Численность и биомасса бактерий в обрастаниях разных видов макрофитов Рыбинского
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.