СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2007, том 21, № 3, с. 263-269
= БИОСЕНСОРЫ
УДК 543.55:57
МИКРОБНЫЕ БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕРРОЦЕНА И БЕНЗОХИНОНА, ПРИМЕНЯЕМЫХ В КАЧЕСТВЕ МЕДИАТОРОВ
© 2007 г. Е. Ю. Чигринова, Е. Е. Бабкина, О. Н. Понаморева, В. А. Алферов,
А. Н. Решетилов1
Тульский государственный университет, 300600, Тула, пр. Ленина, 92 1Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290, г. Пущино, пр. Науки, 5. E-mail: anatol@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 05.11.2006 г.
Показано функционирование безреагентных амперометрических биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans с использованием в качестве медиаторов электронного переноса водонерас-творимых соединений - ферроцена, 1,1'-диметилферроцена, 2,5-дибром-1,4-бензохинона, 2-метил-1,4-бензохинона; возможность использования ацетилферроцена, ферроценкарбальдегида, 2,5-ди-бром-1,4-бензохинона, 2-метил-1,4-бензохинона в качестве медиаторов электронного транспорта в системах "бактериальные клетки-электрод" показана впервые. Время, необходимое для одного измерения, не превышало 7 мин, стандартное отклонение для десяти последовательных измерений составляло 5%, линейный интервал градуировочных кривых составлял 0.25-2 ммоль/л глюкозы для электродов на основе 2,5-дибром-1,4-бензохинона и 2-метил-1,4-бензохинона и 0.25-2,5 ммоль/л для электродов на основе ферроцена и 1,1'-диметилферроцена. Созданные биосенсоры могут быть использованы при решении задач по детекции сахаров и спиртов.
Ключевые слова: медиаторы электронного переноса ферроцены, хиноны, бактериальные клетки.
Медиаторные биосенсоры на основе целых клеток используют для определения легкоутили-зируемых углеводов и спиртов, токсических веществ, биохимического потребления кислорода (БПК) (D'Souza, 2001; Skladal et al., 2002; Katrlik et al., 1997; Pasco et al., 2004; Tkac et al., 2003). В качестве медиаторов переноса электронов в таких биосенсорах применяют различные растворимые в водных средах соединения: комплексные соединения металлов с переменной валентностью, например, гексацианноферрат (III), гексааминорутенат (III), искусственные красители - 2,6-дихлорфенол-индофенол, феназинметосульфат, растворимые ферроцены, хиноны и т.д. Недостатком использования водорастворимых соединений в качестве медиаторов является расход медиатора, который необходимо добавлять в анализируемый образец, и, следовательно, после измерений выбрасывать в окружающую среду. Одним из способов устранения указанных недостатков является разработка так называемых безреагентных медиаторных биосенсоров, в которых необходимые для анализа компоненты (медиатор, биоматериал) иммобилизованы на поверхности электрохимического преобразователя. Основой безреагентных биосенсоров могут служить биоэлектроды, изготовленные на основе углеродной пасты, в состав ко-
торой входит медиатор переноса электронов, а на поверхности иммобилизованы бактериальные клетки. Интерес представляет применение малорастворимых производных ферроцена и хинонов в качестве медиаторов в таких сенсорах. Направленная модификация свойств данных соединений путем введения в их молекулы различных заместителей приводит к изменению их свойств при переносе заряда. Следует отметить, что уже предпринимались попытки создания безреагентных биосенсоров на основе бактериальных клеток G. oxydans. Так, для электрического контакта целых клеток с электродом применяли редокс-по-лимер на основе осмия (Vostiar, Gorton, 2004). В работе (Решетилов и др., 1998) при разработке биосенсора для определения легкоутилизируе-мых углеводов и спиртов в качестве медиатора электронного переноса применяли 1,1'-диметил-ферроцен в сочетании с бактериями G. oxydans. В целом можно отметить, что исследования по созданию безреагентных медиаторных биосенсорных систем на основе целых клеток носят более ограниченный характер в сравнении с разработкой биосенсорных систем на основе ферментов.
Настоящая работа посвящена созданию и изучению свойств безреагентного микробного меди-аторного биосенсора на основе бактерий G. oxy-
dans sbsp. industrius B-1280 и водонерастворимых ферроценов и хинонов. Для исследования были выбраны соединения ферроцен, 1,1'-диметилфер-роцен, ацетилферроцен, ферроценкарбальдегид, 2,5-дибром-1,4-бензохинон, 2-метил-1,4-бензохи-нон, 1,2-нафтохинон. Оценена их эффективность и показана возможность выполнять функции переноса заряда в биоэлектрокаталитическом процессе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Методика измерений с безреагентными микробными медиаторными биосенсорами (БММБ). В работе использовали бактерии О. oxydans sbsp.
В-1280, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Т.К. Скрябина (г. Пущино). Ферроцен, 1,1'-диметилферроцен, ацетилферроцен, ферроценкарбальдегид, 2,5-дибром-1,4-бензохинон, 2-метил-1,4-бензохинон, 1,2-нафтохинон, D-глюкоза были закуплены в фирме "АррН^ет", графитовая пудра - в фирме 'Т1и-ка", масло минеральное - в фирме "Диа-М".
Регистрацию вольтамперограмм проводили по трехэлектродной схеме. Рабочим электродом служил углеродно-пастовый электрод (площадь поверхности 4.8 мм2) с иммобилизованными клетками микроорганизмов, вспомогательным - платиновый электрод. В качестве электрода сравнения использовали насыщенный хлоридсеребря-ный электрод (Ag/AgQ), относительно которого представлены все значения потенциалов. Электрохимические измерения выполнены в цитрат-фосфатном буфере, рН 6.0 при 22°С.
Рабочий (измерительный) электрод формировали, наполняя графитовой пастой пластиковый шприц. Трафитовую пасту готовили смешиванием 100 мг графитовой пудры и 20 мг медиатора с 40 мкл минерального масла. Шприц содержал серебряную проволоку для электрического контакта с частицами графита. Клетки микроорганизмов О. oxydans иммобилизовали следующим образом: на поверхность пасты, заполняющей шприц, наносили 3 мкл суспензии клеток (200 мг сырого веса/мл) и подсушивали при комнатной температуре в течение 15 мин. В исследовании также применяли фиксацию клеток на электроде с помощью диализной мембраны с целью предотвращения их десорбции; для этой цели поверхность электрода с иммобилизованными бактериями покрывали диализной мембраной, которую фиксировали на электроде при помощи резинового держателя. Случаи измерения такими электродами указаны специально. Использовали диализную мембрану фирмы "Сигма" с пределом проницаемости 14 кДа.
Электрохимические измерения проводили при помощи полярографической системы IPC 2000 (Фирма "Кронас", Россия), сопряженной с персональным компьютером Intel Pentium 130 МГц. Вольтамперограммы регистрировали при скорости изменения потенциала 10 мВ/с.
Амперометрические измерения проводили в двухэлектродной ячейке при постоянном потенциале (применяли для 2-метил-1,4-бензохинона 200 мВ; 2,5-дибром-1,4-бензохинона 220 мВ; ферроцена 250 мВ; 1,1'-диметилферроцена 220 мВ). В качестве рабочего электрода использовали углеродно-пастовый электрод с иммобилизованными клетками микроорганизмов. Электродом сравнения служил хлоридсеребряный электрод. Электролитическую ячейку заполняли 4 мл цитрат-фосфатного буфера. Измерения велись при непрерывном перемешивании раствора, находящегося в электролитической ячейке. После установления постоянного уровня тока в ячейку микропипеткой вводили необходимое для получения заданной концентрации количество 1 М или 0.1 М раствора глюкозы. После каждого добавления субстрата проводили промывку ячейки (три промывки по 4 мл цитрат-фосфатным буфером).
Методика измерений кислородным электродом. Кислородный электрод (использовали электрод фирмы "Beckman") заполняли 0.1 М раствором хлорида калия. Клетки микроорганизмов (3 мкл клеточной суспензии с концентрацией 200 мг сырого веса/мл) наносили на хроматогра-фическую бумагу GF/A размером 3 х 3 мм2, подсушивали в течение 30 мин, после чего фиксировали при помощи капроновой сетки на кислородном электроде. Электролитическую ячейку заполняли 4 мл цитратно-фосфатного буфера (pH = 6.0); через 30 мин после погружения электрода в раствор при интенсивном перемешивании добавляли различные объемы 1 М и 0.1 М растворов глюкозы для получения требуемой конечной концентрации. После каждого добавления субстрата проводили промывку ячейки (3 раза по 4 мл цитрат-фосфатным буфером). Зависимость силы тока от времени регистрировали потенциостатом IPC 2000.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Волътамперометрия
Возможность использования веществ с обратимыми окислительно-восстановительными свойствами в качестве медиаторов электронного транспорта изучали методом вольтамперометрии. Появление на циклической вольтамперограмме в присутствии биокатализатора и субстрата пика, соответствующего протеканию в системе каталитического процесса, служило критерием, свидетельству-
ющим о принципиальной возможности использования исследуемого соединения в качестве медиатора.
На рис. 1 (в качестве примера) показано изменение циклических вольтамперограмм для ферроцена при последовательном нанесении бактерий на углеродно-пастовый электрод и добавлении глюкозы в измерительную кювету. Иммобилизация клеток вызывала рост анодного пика (рис. 1, кривая •), что может быть обусловлено окислением восстановленного медиатора электронного транспорта за счет участия в процессе ферментов дыхательной цепи бактерий, функционирующей даже в отсутствие внешних субстратов при наличии эндогенных субстратов. Добавление глюкозы в измерительную кювету приводило к дальнейшему росту пика (рис. 1, кривая в), что указывает на восстановление ферроцена в процессе ферментативного окисления глюкозы и последующее его электрохимическое окисление на электроде. Аналогичные зависимости были получены для электродов, модифицированных 1,1'-диметилферроценом, ацетилферро-ценом, ферроценкарбальдегидом, 2,5-дибром-1,4-бензохиноном, 2-метил-1,4-бензохиноном. Изменение вольтамперных зависимостей позволяет сделать вывод, согласно которому все перечисленные соединения могут служить медиаторами переноса электронов в электродах на основе клеток G. oxydans.
Следует отметить, что возможность использования ацетилферроцена, фе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.