ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 1, с. 106-108
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 631.46:665.6
МИКРОБНЫЕ ПЕЙЗАЖИ В ПОЧВАХ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ
© 2007 г. О. Д. Сидоренко, Т. А. Павликова
Российский государственный аграрный университет - Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева, 127550 Москва, ул. Тимирязевская, 50 E-mail: timacad@mail.ru Поступила в редакцию 28.03.2006 г.
Разработана модификация метода стекол обрастания Н.Г. Холодного, которая позволяет исследовать динамику формирования микробных ценозов в нефтезагрязненных почвах. Микробные прейзажи в них четко дифференцированы в зависимости от типа почвы, качества нефти и степени ее утилизации.
Целью работы было описание динамических изменений микробных пейзажей в почвенных образцах и песке, загрязненных нефтью, с использованием модифицированного метода стекол обрастания Холодного (1935). Суть модификации заключалась в том, что стекла очищали от почвы красителями, применяемыми для идентификации грамположительных и грамотрицательных бактерий (Методы ..., 1983). Известная по литературным материалам модификация методов стекол обрастания касалась замены стекол на агари-зованные стеклянные пластинки (Разумовская и др., 1960), что нарушало экологическую адекватность метода стекол обрастания.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследовали: дерново-подзолистую среднесу-глинистую почву (Лесная опытная дача МСХА), типичный чернозем тяжелосуглинистый (Липецкая обл.) и аллювиальный песок речной террасы (пойма р. Волги). Образцы почв были отобраны из глубины 0.20 см; рНкс1 дерново-подзолистой почвы составлял 5.7, чернозема 7.0, песка 6.8; гумус, %: 3.9, 6.6, 0.4; валовый азот, %: 0.06, 0.21, 0.02 соответственно.
Экспериментальное загрязнение проводили нефтью двух типов. Использовалась нефть Харья-гинского месторождения - высокопарафинистая, сернистая, температура застывания 29°С и нефть Сугмутского месторождения - среднепарафини-стая, сернистая, температура застывания 10°С. Субстрат (почвы, песок) помещали в пластиковые сосуды по 300 г, по вариантам опыта в верхние слои почвы вносили нефти по 300 мг/кг от массы почвы, ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов (титр 1010 КОЕ/г) - в массе 100 мг/кг почвы и выдерживали 10 мес. при влажности 60% от полной влагоемкости и температуре 16-22°С. Предметные стекла чистые и обезжиренные (спиртом с эфиром 1:1) вдвигали в субстрат,
уплотняли его слегка от стенок сосуда и вынимали по мере необходимости и сроков отбора.
Анализ проводили 1 раз в месяц. Варианты опыта: субстрат (почвы и песок) - контроль, два типа нефти и водородокисляющие микроорганизмы. Микробный консорциум биопрепарата "составлен" на основе штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida, Rhodococcus ruber, Trichoderma citrinoviride и Me-tarrhizium anisopliae. Опыт был поставлен в трехкратной повторности.
При микроскопическом исследовании экспериментального препарата отмечается характер микрофлоры, прилипшей к стеклу, плотность обрастания и доминирующие формы микроорганизмов, обнаруживаемых на стекле. Микробный пейзаж (отпечаток) отражает микрофлору данной почвы в ее естественном распределении. Для количественного учета этот метод, по-видимому, непригоден, но относительную картину богатства почвы теми или другими микроорганизмами, он показывает.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Модифицированный метод стекол обрастания позволил оценить своеобразие микробных пейзажей по морфологическому многообразию про- и эукариотных микроорганизмов, закрепившихся на стеклах за время контакта с почвой и сформировавших первичные колонии в почвах и песке, загрязненных нефтью. При помощи способа "отпечатков" можно изучать почву как среду для жизнедеятельности микробов, а привнесенный углеродсодержащий субстрат влияет на характер формирования микробного ценоза, его структур и их активность.
Использование системы красителей, применяемых для окраски бактерий по Граму, открыло возможность дополнительной дифференциации прокариот на стеклах обрастания. Интерес пред-
МИКРОБНЫЕ ПЕЙЗАЖИ В ПОЧВАХ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ
107
^988
Рис. 1. Микропейзаж на стеклах обрастания в нефте-загрязненной дерново-подзолистой почве: а - фрагменты мицелия актиномицета; б - гифы гриба. Све-тооптическая микроскопия. Ув. Х1350 (для рис. 1-3).
Рис. 2. Плотность обрастания и доминирующие формы микроорганизмов в нефтезагрязненном песке: а -грамотрицательные кокковидные и палочковидные бактерии; б - грамположительные дрожжи и дрож-жеподобные клетки.
ставляла как общая картина микробных пейзажей так и приуроченность к испытавшимся образцам почвы и песка. В загрязненной нефтью дерново-подзолистой почве и песке наблюдали доминирование актиномицетов, а также грибов и разнообразных популяций преимущественно грамположи-тельных бактерий (рис. 1). При анализе стекол мы отмечали характер микробов, прикрепившихся к стеклу, и плотность обрастания микроорганизмов. Часто наблюдалось обрастание клетками бактерий гиф грибов, особенно ярко это проявлялось в черноземе, загрязненном нефтью. В одних случаях это приводило к полному лизису мицелия гриба бактериями, в других - оба микроорганизма выигрывали от такого тесного сожительства, что приводило к их активному развитию.
Микробный ценоз речного песка, загрязненного нефтью, был представлен в основном актино-мицетами и грибами, сохранявшимися в течение
всего периода наблюдений (6 мес.). В некоторых вариантах опыта (при внесении углеводородокисля-ющих бактерий) доминировали грамположительные кокки и палочки (рис. 2). Установленное своеобразие ценозов песка возможно связана со слабой его адсорбционной способностью и следовательно с видовой обедненностью микроорганизмами.
Чернозем, загрязненный нефтью, в отличие от других образцов, характеризовался большим разнообразием и обильным развитием грамположи-тельных бактерий, дрожжей и актиномицетов (рис. 3). По-видимому, разнообразие микроорганизмов чернозема в отличие от дерново-подзолистой почвы и песка находится в прямой зависимости от богатства почвы илистыми и пылеватыми частицами и органическим веществом, влияющим на сорбционные характеристики исследуемых образцов и активность микроорганизмов.
108
СИДОРЕНКО, ПАВЛИКОВА
Многочисленные микробные пейзажи на стеклах обрастания в целом отражают динамичность сукцессий микроорганизмов нефтезагрязненных почв. Их бактериальный ценоз характеризуется четкой дифференциацией во времени. В начале опыта (до 2 мес.) процесс минерализации нефти в почвах осуществляют представители бактерий палочковидной формы разной величины. Далее (после 2 мес.) - доминантами являются актиноми-цеты и грибы. Главное место в пейзажах занимают гифы стрептомицетов и микромицетов. Гифы последних нередко образуют здесь большие густые сплетения или обнаруживаются в виде отдельных нитей мицелия. В нефтезагрязненных почвах часто доминируют дрожжи и дрожжепо-добные клетки - в вариантах без внесения биопрепарата. При внесении биопрепарата - деструктора нефти, разработанного авторами (Сидоренко, Павликова, 2003 г.), в исследуемые почвы и песок наблюдали перераспределение основных доминирующих форм микроорганизмов нефтезагрязненного образца на представителей интродуцированной ассоциации.
Титр инокулированных клеток в начале опыта (через 5-7 сут) постепенно снижался (по-видимому, наблюдался адаптационный эффект), а к 30-м сут эксперимента стабилизировался. При этом установлена активная адаптация бактериальных штаммов в нефтезагрязненных почвах (Павликова, 2004).
Микроорганизмы, обнаруживаемые на стеклах обрастания, можно рассматривать как активную микрофлору почвы, в противоположность потенциальной микрофлоре, вырастающей в посевах на питательные среды. Состав микроорганизмов, выявляемых на питательных средах и на стеклах обрастания может быть весьма различен. Препараты отражают не только определенный момент в жизни почвы или песка, но и позволяют проследить динамику развития микроорганизмов.
Таким образом, предлагаемая модификация метода стекол обрастания Холодного информативна и адекватна естественным условиям.
» *
К
Рис. 3. Дрожжи в нефтезагрязненном черноземе.
Авторы благодарят К.Д. Ашмяна (ВНИИ газа
и нефти им. Крылова) за любезно предоставленные образцы нефти.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Методы общей бактериалогии. Т. 1. М.: Мир, 1984. С. 67-70.
Сидоренко ОД, Лубников СИ, Павликова Т.А. Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов: Пат. № 2264357.2003.
Павликова Т.А. Деградация нефти ассоциацией аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов в различных типах почв: Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: МСХА им. К.А. Тимирязева, 2004. С. 20-22.
Разумовская З.Г, Чижик Г.Я, Громов Б.В. Лабораторные занятия по почвенной микробиологии. Л.: Изд-во ЛГУ, 1960. С. 138-140.
Холодный Н.Г. Методы непосредственного наблюдения в почве нной микробиологии // Микробиология. 1935. Т. 4. Вып. 1. № 4. С. 75-79.
Microflora Patterns in Oil-Contaminated Soils
O. D. Sidorenko and T. A. Pavlikova
Russian State Agrarian University, Timiryazevskaya ul. 50, Moscow, 127550 Russia
e-mail: timacad@mail.ru
Abstract—The method of glass slides was modified to study the dynamics of microbial cenoses in oil-contaminated soils. The resulting microflora patterns can be clearly distinguished between soil types and oil quality and utilization.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.