МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 3, с. 355-365
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.266:553.981 '982
МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА ЗОНЫ РАЗГРУЗКИ ГАЗОНЕФТЕСОДЕРЖАЩИХ ФЛЮИДОВ УЛЬТРАПРЕСНОГО ОЗЕРА БАЙКАЛ
© 2014 г. А. В. Ломакина*, 1, Т. В. Погодаева*, И. В. Морозов**, Т. И. Земская*
*Лимнологический институт СО РАН, Иркутск **Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск
Поступила в редакцию 15.07.2013 г.
В районе естественного нефтепроявления в Среднем Байкале молекулярно-биологическими методами исследовано разнообразие микроорганизмов в сообществах донных осадков, различающихся по химическому составу поровых вод. В осадках, насыщенных нефтью и метаном, выявлены представители 10 филумов бактерий и двух филумов архей. В окисленном слое осадка обнаружены ме-танотрофные бактерии, принадлежащие классу и-Рго1еоЬас1епа, которые отличались по структуре гена ртоА и формировали отдельный кластер с некультивируемыми метанотрофами из холодных экосистем. В поверхностном осадке также найдены нефтеокисляющие бактерии и а1кВ гены, имеющие наибольшее сходство с а1кВ генами бактерий рода Екойососст. Микробное сообщество восстановленных осадков характеризовалось меньшим разнообразием и было представлено, главным образом, организмами, участвующими в биодеградации углеводородов.
Ключевые слова: микробные сообщества, аэробная деградация углеводородов, а1кВ и ртоА гены, озеро Байкал, естественное нефтепроявление.
DOI: 10.7868/S0026365614030124
Природные нефтепроявления поставляют большие количества углеводородов в окружающую среду. Они подпитываются подземными источниками нефти, из которых нефть мигрирует через каналы в породе и проницаемые осадки в водную толщу. Природные нефтепроявления найдены в различных районах мира — от тропиков до полярных зон [1, 2]. На фоне столь обширного распространения неф-тепроявлений в мире в пресноводных озерах они встречаются крайне редко. В их число входят рифтовое глубоководное озеро Танганьика [3], мелководное озеро Чапала [4], а также глубоководный Байкал [5, 6].
В 2005 г. в Среднем Байкале у м. Горевой Утес был обнаружен новый район, где ежегодно происходит разгрузка нефти (до 4 т в год) и метана. Здесь на поверхности дна формируются битумные постройки, а в приповерхностных слоях донных осадков, пропитанных нефтью, обнаружены газовые гидраты (ГГ) [7]. В этом районе отмечаются потоки минерализованных флюидов различного состава, что характерно для сопутствующих нефти вод [8]. Микробиологические исследования выявили разнообразные культивируемые аэробные углеводородокисляющие микроорганизмы
1 Автор для корреспонденции (e-mail: lomakina@lin.irk.ru).
(УВОМ), которые способны использовать широкий спектр углеводородов [9]. Анализ чистых культур, выделенных из водной толщи и донных осадков, показал наличие в их геномах а1кВ генов [10], кодирующих ключевой фермент окисления алканов алкан-1-монооксигеназу (напр., [11]). В битумных постройках, формирующихся в местах разгрузки нефти, методом пиросеквенирования обнаружены различные группы микроорганизмов, осуществляющие аэробную биодеградацию ароматических соединений и н-алканов, и не отмечены бактерии, способные осуществлять анаэробную деградацию н-алканов [12].
Цель данного исследования — оценить разнообразие микробного сообщества в осадках, насыщенных нефтью, из района естественного нефтепроявления у м. Горевой Утес, а также его метаболический потенциал в окислении углеводородов на основе анализа структуры генов 168 рРНК, ртоА и а1кВ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Отбор проб. Для исследования было взято три образца донных осадков, полученных с помощью гравитационной трубы в одной координате (53°18'33'' с.ш., 108°23'46" в.д.) в зоне разгрузки уг-
Таблица 1.
Химический состав поровой воды исследованных слоев донных осадков м. Горевой Утес
Станция Горизонт, см Концентрация, мг/л
HCO- NH+ Cl- NO- SO4- Fe Na+ K+ Ca2+ Mg2+ £ ионов
St3 GC-1 (образец № 1) 0-5 183 20 0.6 -* 4.7 15 3 39 4 250
St7 GC-1 (образец № 2) 180-190 108 0.2 0.8 7 2 25 3 146
St24 GC-5 (образец № 3) 170-175 30 4.2 0.6 3 0.2 8 2 4 1 53
Фоновые районы 0-5 67 0.5 0.4 0.1 5.3 0.02 3.5 0.9 16 3 96
* Не обнаружен. ** Не исследован.
леводородов у м. Горевой Утес (10 км от берега, глубина 900 м, Средний Байкал) в летних экспедициях 2006—2007 гг. Все образцы характеризовались наличием нефти и различались по химическому составу поровых вод. Первый образец (далее по тексту № 1) был отобран из окисленного поверхностного слоя осадка (0—5 см) St3 GC-1, второй (№ 2) и третий (№ 3) из глубинных восстановленных осадков: St7 GC-1 (180-190 см) и St24 GC-5 (170-175 см), соответственно. Образец № 3, кроме нефти, содержал ГГ. В слоях донного осадка, откуда были отобраны образцы для молекулярного анализа, был исследован химический состав поровых вод по методике, описанной ранее [13].
Выделение суммарной бактериальной ДНК и амплификация генов 16S рРНК, pmoA и alkß. Выделение ДНК исследованных образцов, содержащих нефть и ГГ, проводили в соответствии с методикой, описанной ранее [14].
Амплификацию генов 16S рРНК проводили с использованием универсальных бактериальных (5001, 1350r) [15] и архейных (20f, 958r) праймеров [16], для детекции планктомицетов использовали прайме-ры P1a58f, P1a926r [17]. Для амплификации гена pmoA использовали праймеры A189f, A682r [18], для alkß гена — a1kB3f, a1kB3r [19]. ПЦР проводили по методике, описанной ранее [14, 20].
Клонирование и секвенирование ПЦР-продук-тов. Очищенные фрагменты генов pmoA, alkß и 16S рРНК бактерий, архей, планктомицетов длиной от 300 до 940 нуклеотидов были клонированы в плазмидный вектор pGEM-T Easy Vectors ("Promega", США). Реакцию Сэнгера с использованием реактива BigDye Terminator Kit v.3.1 ("Applied Biosystems") и анализ ее продуктов осуществляли на генном анализаторе ABl 3130x1 в Центре коллективного пользования "Геномика" СО РАН (г. Новосибирск).
Филогенетический анализ. Последовательности анализировали с использованием программы BLAST сервера NCBI (http://www.nc-bi.n1m.nih.gov/b1ast/). Для исключения химер полученные последовательности проверяли в он-
лайн системе Pintail (http://www.bioinformatics-toolkit.org/Web-Pintail/). Транслирование аминокислотных последовательностей генов pmoA и alkß осуществляли в он-лайн системе http://web.ex-pasy.org/tools/translate/. Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора Bio Edit. Для выравнивания последовательностей использовали алгоритм CLUSTALW. Филогенетические деревья были построены, используя метод объединения ближайших соседей (NJ) с Kimura two-parameters алгоритмом в программе MEGA версия 4.0 [21]. Полученные нуклеотидные и аминокислотные последовательности фрагментов генов 16S рРНК, alkß и pmoA депонированы в базу данных GenBank под номерами FJ555263-FJ555281, GU911376—GU911393, GU911408-GU911421, GU911427—GU911451, GU911458, JN832616—JN832669, HQ891150-HQ891193, JQ040551-JQ040569, KF302422-KF302428.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Литология и химический состав в поровых водах. Донные осадки в районе м. Горевой Утес представлены тонкими алеврито-пелитовыми биогенно-терригенными илами. Характеристика состава поровых вод исследуемых образцов приведена в табл. 1. В образце № 2 был обнаружен канал, заполненный нефтью и более жидким (до 85% влажности) осадком.
В поровых водах образца № 1 по сравнению с фоновыми районами озера Байкал отмечены повышенные концентрации НСО- (до 183 мг/л), ионов Na+ (до 15 мг/л), ионов Са2+ (до 39 мг/л). Почти на порядок повышено содержание общего
Fe (4.7 мг/л) и на два порядка NH+ (до 20 мг/л) [13]. В составе поровых вод данного образца не опреде-
— 2-
лялись ионы NO3 и SO4 . В поровых водах образца
№ 2, концентрация НСО- была ниже, чем в образце № 1 (108 мг/л), но выше фоновых значений (67 мг/л). Содержание ионов Cl- не превышало
— 20.2 мг/л, а NO3 и SO4 в поровых водах исследо-
ванного слоя осадка отсутствовали. Концентрация общего Fe (0.8 мг/л) сопоставима с таковой в фоновых районах озера Байкал [13]. Химический состав поровых вод образца № 3 характеризовался
пониженными значениями НСО- (30 мг/л), что, скорее всего, обусловлено разложением ГГ. В этом образце была повышена концентрация
ионов Cl- (до 4.2 мг/л), регистрировались NO-
(0.6 мг/л) и SO4- (3 мг/л) ионы, отсутствовавшие в других исследованных образцах.
Гены 16S рРНК представителей домена Bacteria.
С использованием универсальных бактериальных праймеров для трех исследованных образцов была создана библиотека из 106 клонов.
Из образца № 1 было проанализировано 45 последовательностей, отнесенных к следующим филумам: Proteobacteria (классы в-, y-, 8-), Verru-comicrobia, Nitrospirae, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Chlorobi и Actinobacteria. Их ближайшие гомологи были изолированы из донных осадков различных рек и озер мира, почв, загрязненных нефтью и другими органическими соединениями. Среди полученных последовательностей доминировали представители филума Proteobacteria. Среди в-Proteobacteria три последовательности (4.16, 4.24, 4.33) имели 98% сходства с Burkholderia sp., выделенной из почв, загрязненных нефтью (Acc. № DQ777736). Нуклеотидные последовательности (7 клонов), относящиеся к классу у-Proteobacteria, с 98-99% сходства были представлены метанотрофными бактериями Me-thylobacter tundripaludum, участвующими в окислении метана в арктических почвах (AJ414655) и содовых озерах Бурятии (AF152597). Еще одна нук-леотидная последовательность (4.86) этого класса на 97% сходна с некультивируемым представителем, выделенным из водной толщи Берингова моря (GQ850552) (рис. 1). Одна нуклеотидная последовательность (4.35) с 99% сходством была близка некультивируемой бактерии, изолированной из загрязненных нефтью донных осадков (AM882607) и отнесена к классу 8-Proteobacteria. Остальные нуклеотидные последовательности из этого образца были отнесены к филумам Verru-comicrobia (2 клона), Nitrospirae (2), Chloroflexi (3), Planctomycetes (2), Acidobacteria (4), Chlorobi (1) и Actinobacteria (3) (рис. 1). С различным уровнем сходства (87-99%) также выявле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.