ЭКОЛОГИЯ, 2004, № 3, с. 205-209
УДК 591.69-7-51+591.132.6
МИКРОФЛОРА, АССОЦИИРОВАННАЯ С ПИЩЕВАРИТЕЛЬНО-ТРАНСПОРТНЫМИ ПОВЕРХНОСТЯМИ РЫБ И ПАРАЗИТИРУЮЩИХ В НИХ ЦЕСТОД
© 2004 г. Г. И. Извекова, Н. Ä. Лаптева
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН 152742 Ярославская обл., Некоузскийр-н, п. Борок Поступила в редакцию 05.01.2003 г.
Установлено существование симбионтной микрофлоры, с различной степенью прочности ассоциированной с пищеварительно-транспортными поверхностями кишечников щуки, налима и паразитирующих в них цестод T. nodulosus и E. rugosum соответственно, а также плероцеркоида L. intestinalis из полости тела леща. Небольшое количество из этих бактерий обладает амилолитической и протеолитической активностью, что позволяет предположить их участие в процессе пищеварения как хозяина, так и паразита.
Ключевые слова: рыбы, цестоды, симбионтная микрофлора, численность, биомасса, протеолитиче-ская активность, амилолитическая активность.
Известно, что бактериальная флора представляет собой необходимый атрибут существования сложных организмов. Микроорганизмы и паразиты, населяющие кишечник, вместе с физико-химическими ингредиентами создают эндоэкологическую среду рыб, поэтому взаимоотношения, возникающие между составляющими этой среды, необходимо постоянно учитывать. В настоящее время схема пищеварения у рыб рассматривается как состоящая из шести звеньев, одним из которых является симби-онтное пищеварение, реализуемое при участии ферментов кишечной микрофлоры (Кузьмина и др., 2000). В результате жизнедеятельности симбионтной микрофлоры образуются пищевые вещества, не нуждающиеся в дальнейшем гидролизе - аминокислоты, глюкоза, жирные кислоты и др. (Уголев, 1985). Микрофлора кишечника синтезирует многие витамины, необходимые для жизнедеятельности не только хозяина, но и паразита (Шишова-Касаточки-на, Леутская, 1979).
Существует обширная литература, посвященная количественному и видовому составу энтеральной микрофлоры позвоночных животных, и в частности рыб (Лубянскене и др., 1989; Cahill 1990; Clements, 1997). Важный аспект изучения кишечной микрофлоры - ее роль в питании, осуществляющаяся за счет выделения внеклеточных ферментов, способных принимать участие в гидролизе биополимеров. Например, в желудках 17 из 62 исследованных видов рыб обнаружена целлюлазная активность, которая, очевидно, является следствием продукции этого фермента кишечной микрофлорой (Cahill, 1990). Взаимоотношения между микрофлорой кишечника и гельминтами, обитающими в нем, изучены недостаточно (Mettrick, Podesta, 1974; Arme et al., 1983). Сведения о радиальном градиенте распреде-
ления микрофлоры в кишечниках рыб и паразитирующих в них цестод в доступной нам литературе отсутствуют. Также отсутствуют данные о микрофлоре, связанной с полостью тела рыб и паразитирующих в ней гельминтов, в частности L. intestinalis.
В связи с этим целью нашей работы было исследование симбионтной микрофлоры, ассоциированной с пищеварительно-транспортными поверхностями кишечников некоторых видов пресноводных рыб и паразитирующих в них цестод.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектом исследований служили слизистая кишечника щуки Esox lucius и налима Lota lota, а также цестоды Triaenophorus nodulosus и Eubotrium rugosum, обитающие в них соответственно. Кроме того, были исследованы плероцеркоиды Ligula intestinalis, обитающие в полости тела леща Abramis brama. Рыбу отлавливали в Рыбинском водохранилище в период интенсивного питания: налима - в январе, щуку - в апреле-мае и леща - в июле-августе. Поскольку активность пищеварительных ферментов рыб зависит от многих факторов, в том числе и от возраста (Уголев, Кузьмина, 1993), при исследовании кишечной симбионтной микрофлоры у каждого вида рыб использовали близкие размерно-возрастные группы (щука - длина тела 300-380 мм, налим -400-500 мм, лещ - 230-280 мм). Из кишечника щуки и налима извлекали по 5-10 червей в каждом опыте; масса паразитов колебалась от 250 до 450 мг для T. nodulosus и от 790 до 1520 мг - для E. rugosum. Из полости тела леща извлекали по одному плероцер-коиду L. intestinalis: размер червей варьировал от 150 до 250 мм, масса - от 8.86 до 17.78 г.
В каждом опыте исследовали 2-3-см отрезки среднего отдела кишечника рыб и целых червей.
Перед вскрытием кишечники для стерилизации поверхности промывали в спирте, затем вскрывали в стерильных условиях. В случае с L. intestinalis червей извлекали из полости тела рыбы, предварительно протертой для стерилизации поверхности спиртом. Смывы с кишечников рыб и поверхности червей для дальнейших микробиологических посевов получали, используя схему метода последовательной десорбции ферментов с отрезков кишки (Кузьмина, 1976).
Отрезки кишечника и червей, извлеченных из него, помещали в колбы с 15 мл стерильного раствора Рингера для холоднокровных животных (pH 7.4) и встряхивали. Затем в стерильных условиях препараты последовательно переносили в другие колбы с раствором Рингера и повторяли встряхивание. Первую фракцию Д1 получали после 30-секундного встряхивания, остальные (Д2-Д7) -через каждые последующие 15 мин. Для микробиологических исследований щуки и T. nodulosus использовали фракции Д1, Д3, Д5 и Д7, для налима и E. rugosum - Д1, Д3 и Д5, для L. intestinalis - Д1, Д2 и Д3. В этих фракциях определяли общее количество бактерий методом прямого счета с использованием эпифлуоресцентной микроскопии и их биомассу (Кузнецов, Дубинина, 1989). Численность бактерий выражали в млн. клеток, а биомассу в мг на 1 г влажной навески ткани, с которой получен смыв.
Для выявления групп бактерий, обладающих протеолитической активностью, производили посевы в чашках Петри на следующие питательные среды: 1) стандартный РПА - рыбопептонный агар; 2) РПА/10 - рыбопептонный агар, разведенный в 10 раз; 3) казеиновый агар - 10 г гидролиза-та казеина на 1 л раствора Рингера; 4) молочный агар - обезжиренное молоко на 3%-ном агар-агаре (1 : 1). Для выявления групп бактерий, обладающих амилолитической активностью, аналогичные посевы производили на среду Имшенецкого
и на среду, содержащую РПА/10 плюс 10 г/л растворимого крахмала (Кузнецов, Дубинина, 1989).
Через 5-7 сут инкубации при 20°С производили подсчет выросших на твердых средах колоний и их количество рассчитывали на 1 г влажной навески ткани, с которой получен смыв, учитывая разведение навески. Число клеток выражали также в процентах по отношению к общему числу бактерий.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате проведенных исследований установлено наличие микрофлоры, ассоциированной с поверхностями слизистой кишечников рыб и тегу-ментами цестод. При описании и интерпретации результатов учитывали тот факт, что прочность ассоциации бактерий с пищеварительно-транс-портными поверхностями увеличивается в ряду Д1-Д7. Наибольшая численность бактерий отмечена на слизистой кишечника щуки и на поверхности ее паразита T. nodulosus (табл. 1). На слизистой кишечника щуки от фракции Д1 до фракции Д7 общая численность бактерий снижается в 6 раз (от 407.0 ± 135.25 до 73.6 ± 19.22 млн. кл./г), в то время как на тегументе T. nodulosus - в 47 раз (от 1177.6 ± ± 433.44 до 25.34 ± 12.5 млн. кл./г). На слизистой кишечника налима и тегументе паразитирующего в нем E. rugosum бактерии распределены более равномерно во всех фракциях. Общее число бактерий из смывов с поверхности L. intestinalis достоверно уменьшается от фракции Д1 (58.38 ± 5.58 млн. кл./г) до фракции Д3 (22.66 ± 2.71 млн. кл./г) в 2.6 раза (P < 0.05). Со слизистой кишечника щуки во фракциях Д1-Д5 ассоциируется примерно в 9 раз больше бактерий, чем со слизистой кишечника налима, а с тегументом T. nodulosus - в 12 раз больше бактериальных клеток, чем с поверхностью E. rugosum, и в 13 раз больше, чем с таковой L. intestinalis. Количество бактерий, связанных с поверхностями E. rugosum и L. intestinalis, сопоста-
Таблица 1. Общая численность (над чертой, млн. кл./г) и биомасса (под чертой, мг/г) бактерий, смытых с пище-варительно-транспортных поверхностей кишечников рыб и тегументов цестод
Объект исследования Фракция
Д1 Д3 Д5 Д7
Щука, Esox lucius 407.00 ± 135.25 283.80 ± 112.34 113.60 ± 23.16 73.60 ± 19.22
1. 68 ± 0.55 2.60 ± 1.12 1 .82 ± 0.80 1. 0 8 ± 0.40
T. nodulosus 1177.60 ± 433.44 264.20 ± 94.46 131. 80 ± 38.57 25.34 ± 12.50
3 .40 ± 1.26 0 .48 ± 0.17 0 .14 ± 0.04 0. 03 ± 0.01
Налим, Lota lota 33.25 ± 11.49 32.45 ± 10.10 26 .13 ± 9.39
0.005 ± 0.002 0.005 ± 0.002 0. 0 1 1 ± 0.004
E. rugosum 1 9 .13 ± 7.76 0.004 ± 0.002 45.75 ± 19.16 0.0 1 0 ± 0.005 49.95 ± 16.83 0.0 1 2 ± 0.004 -
Д1 Д2 Д3
L. intestinalis 58.38 ± 5.58 4 1 .88 ± 6.54 22.66 ± 2.71
0.009 ± 0.001 0.006 ± 0.001 0.004 ± 0
МИКРОФЛОРА, АССОЦИИРОВАННАЯ... 207
Таблица 2. Количество колоний бактерий (тыс. кл./г), выросших на твердых питательных средах, из смывов с пищеварительно-транспортных поверхностей рыб и цестод
Объект исследования Фракция РПА РПА/10 Казеиновый агар Молочный агар Крахмальный агар РПА/10 + + крахмал
Щука, Esox lucius Д1 63.4 ± 25.1 151.47 ± 52.42 107.6 ± 45.5 20.83 ± 9.68 74.7 ± 23.3 154.67 ± 54.26
Д3 31.3 ± 9.4 23.50 ± 12.88 23.7 ± 12.8 32.29 ± 12.6 52.6 ± 28.1 15.55 ± 13.03
Д5 21.6 ± 11.8 3.57 ± 2.10 9.7 ± 4 7.15 ± 2.08 7.5 ± 2.3 3.01 ± 2.66
Д7 0 0.32 ± 0.32 0 - 0 0.25 ± 0.12
T. nodulosus Д1 152 ± 38.6 452.77 ± 168.50 85.6 ± 30.6 41.52 ± 14.12 124.5 ± 34.9 305.18 ± 165.23
Д3 62.8 ± 21.6 279.08 ± 176.41 22.3 ± 8.4 11.06 ± 2.8 49.1 ± 25.1 277.89 ± 151.42
Д5 16.2 ± 6 85.43 ± 60.50 20.3 ± 8.3 2.78 ± 1.11 15.6 ± 7.1 195.45 ± 155.24
Д7 0 32 ± 30 7.1 ± 7.1 - 6 ± 6 13.2 ± 10.3
Налим, Lota lota Д1 4.85 ± 1.56 5.8 ± 1.78 3.45 ± 1.35 0.51 ± 1.53 - 3.83 ± 0.5
Д3 1.03 ± 0.45 0.73 ± 0.5 3.1 ± 0.08 0 ± 1.59 - 0.08 ± 0
Д5 0.08 ± 0.08 0 0 ± 0.01 0 - 0.01 ± 0
E. rugosum Д1 11.15 ± 4.84 7.55 ± 2.33 3.6 ± 2.52 0.05 ± 0.05 - 5.23 ± 0.05
Д3 1.63 ± 0.53 0.83 ± 0.43 0.2 ± 0.4 0 - 0.7 ± 0
Д5 0.2 ± 0.2 0.05 ± 0.05 0 0 - 0
L. intestinalis Д1 8.4 ± 6.13 5.67 ± 3.42 4.43 ± 2.99 1.12 ± 0.65 7.95 ± 4.58 3.42 ± 2.28
Д2 1.6 ± 1.1 1.12 ± 0.87 0.22 ± 0.12 0.01 ± 0 1.76 ± 1.27 0.57 ± 0.24
Д3 0.03 ± 0.0
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.