ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 2, с. 239-243
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 57.083.18:552.576.1
МИКРООРГАНИЗМЫ БУРОГО УГЛЯ
© 2007 г. М. А. Буланкина, Л. В. Лысак, Д. Г. Звягинцев
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения,
119992 Москва, Ленинские горы
E-mail: lvlysak@mail.ru Поступила в редакцию 30.05.2006 г.
Впервые показано, что образцы бурого угля, залегающего на глубине 10 м, значительно обогащены бактериями. По данным прямого микроскопического метода численность бактерий составляет около 10' клеток/г. Около 70% клеток имели неповрежденную клеточную мембрану и мелкие размеры, что свидетельствует о том, что они находятся в анабиотическом состоянии. Длина грибного мицелия составляла не более 1 м. Посев бурого угля на плотную глюкозо-пептонно-дрожжевую среду позволил выделить бактерии родов Bacillus, Rhodococcus, Arthrobacter, Micrococcus, Spirillum и Cytophaga. На среде Чапека обнаруживались представители родов Pénicillium и Trichoderma. Увлажнение измельченного бурого угля приводило к увеличению интенсивности дыхания микроорганизмов, увеличению численности бактерий и грибов, однако не увеличивало их родового богатства. Это позволяет предположить, что изученные микроорганизмы являются автохтонными для бурого угля.
Важной проблемой микробной экологии является вопрос о проникновении микроорганизмов вглубь литосферы. Если микрофлора и микробные процессы в почве достаточно детально изучены (Добровольская, 2002; Звягинцев, 1987) то нижележащие слои литосферы изучены значительно слабее.
Имеются отдельные разрозненные сведения о бактериальном населении осадочных пород, иловых отложений озер и морей, погребенных почв, песчаников, гранитных и базальтовых пород, артезианских вод (Экзерцев, 1948; Смирнова, 1957; Harvey, 1997; Balk et al., 1997; Pedersen, 1997). В этих работах для изучения численности микроорганизмов использовали прямые микроскопические методы, методы посева, а также современные методы анализа 16S рРНК, полимеразную цепную реакцию (Наумова, 1933; Amann et al., 1997; Chan et al, 1997; Balk et al., 1997; Pedersen, 1997). Однако микроорганизмы бурых углей оставались практически вне поля зрения исследователей: в доступной нам литературе только в работах Таусона (Таусон, 1947) и Fakoussa (Fakoussa, Hofrichter, 1999) встречается упоминание о бактериях, обнаруживающихся в буром угле.
Помимо теоретического интереса изучение микроорганизмов бурого угля имеет и практическое значение, поскольку бурый уголь, помимо традиционного использования его как топлива, начинает широко использоваться в биотехнологии как сырье для производства гуминовых удобрений, восков, смол и некоторых других продук-
тах, использующихся в разных отраслях химической промышленности (Crawford et al., 1990).
Целью настоящей работы было получение микробиологической характеристики бурого угля для выявления специфических особенностей микробного населения этого субстрата.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследовали образцы бурого угля Гусиноозер-ского месторождения (Бурятия) с глубины 10 м. Образцы были отобраны с соблюдением правил стерильности из центральной части монолита размером 15 х 20 х 15 см. Для микробиологического анализа образцы с соблюдением правил стерильности измельчали в агатовой ступке до состояния пудры. Всего было проанализировано 12 индивидуальных образцов.
Для определения общей численности бактерий и длины грибного мицелия прямым микроскопическим методом и изучения структуры бактериального и грибного комплексов методом посева навеску измельченного бурого угля (1 г) помещали в 100 мл стерильной водопроводной воды. Для десорбции микроорганизмов с поверхности частиц суспензию угля обрабатывали на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-1 (22 кГц; 0.44 А; 2 мин).
Общую численность бактерий и длину грибного мицелия определяли прямым микроскопическим методом с использованием люминесцентных красителей. Для количественного учета бактерий использовали акридин оранжевый,
традиционно используемый в почвенной микробиологии, и краситель L-7012, который представляет собой комбинацию флюорофоров SYTO 9 и пропидиум йодида (фирма "Molecular Probes", США). Использование L-7012 позволяет разделить интактные клетки (зеленое свечение) и клетки с поврежденной клеточной мембраной (красное свечение) (Малеев, Гинцбург, 2004).
Для изучения таксономического состава са-протрофного бактериального комплекса использована глюкозо-пептонно-дрожжевая среда с антибиотиком нистатином для ингибирования роста грибов. Выделенные культуры бактерий идентифицировали на основании морфологических, культуральных и хемотаксономических признаков (Лысак и др., 2003).
Микроскопические грибы учитывали на среде Чапека. Для ингибирования роста бактерий в среду добавляли молочную кислоту (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Идентификацию грибов проводили по (Doms et al., 1993). Результаты выражали в колонеобразую-щих единицах на 1 г субстрата (КОЕ/г) (Методы..., 1991).
Об активности нативных микроорганизмов бурого угля судили по способности к эмиссии СО2. В пенициллиновые флаконы вносили 5 г измельченного образца бурого угля и добавляли 1 мл стерильной водопроводной воды. Интенсивность использования препарата бурого угля определяли по скорости эмиссии СО2 при помощи газохрома-тографического метода (Степанов, Лысак, 2002).
Для изучения способности микроорганизмов развиваться в препарате бурого угля, был поставлен модельный опыт. Измельченный порошок бурого угля смачивали небольшим количеством стерильной водопроводной воды и определяли общую численность клеток бактерий, длину грибного мицелия и таксономический состав бактерий и грибов на 1, 3 и 14-е сут от начала эксперимента на глюкозо-пептонно-дрожжевой среде и среде Чапека.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Общая численность бактерий в буром угле (окраска акридином оранжевым) составляла около 2.5 х 107 клеток/г (кл./г) субстрата. Применение красителя L-7012 показало, что в образцах бурого угля присутствовали как клетки с ненарушенными мембранами (интактные), окрашивающиеся в зеленый цвет, так и клетки с поврежденными мембранами (нарушенные), окрашивающиеся в красный цвет (Terz et al., 1996). Общая численность бактерий составляла около 2.4 х 107 кл./г, что сравнимо с показателями численности, полученными после окраски препаратов акридином оран-
жевым, красителем, традиционно использующимся в почвенной микробиологии. Доля интакт-ных клеток составляла около 70%, а клеток с поврежденной мембраной было около 30%. Следует отметить, что численность бактерий в буром угле была на 2 порядка меньше показателей численности бактерий в верхних горизонтах почв, где их численность обычно составляет от 9-10 млрд. кл./г почвы (Полянский и др., 2004).
Длина грибного мицелия в образцах бурого угля составляла около 0.9 м/г, что несравненно ниже, чем в верхних горизонтах почв (несколько км/г) и сравнимо с показателями численности в нижних минеральных горизонтах почв.
Некоторые авторы считают, что условия образования бурых углей сходны с условиями образования современных торфов (Таусон, 1947), поэтому представляло определенный интерес сравнить полученные нами результаты с имеющимися в литературе показателями общей численности бактерий и длины грибного мицелия в высокозольном торфянике под черноольшанником (Головченко и др., 1993). В низинном торфянике общее количество бактериальных клеток составляло 1010 кл./г, что выше показателей численности бактерий в буром угле, длина грибного мицелия в низинном торфянике была почти на порядок (около 10 м) выше, чем в буром угле (0.9 м), а в верховом торфянике длина грибного мицелия составляла около 1 км/г.
Традиционный метод посева показал, что на использованной нами среде из образца бурого угля выделялись обычные сапротрофные бактерии, характерные для почв. Численность их в среднем составляла 7.3 х 104 КОЕ/г, что на 2 порядка ниже, чем в почвах и на 3 порядка ниже, чем в низинном торфянике (Головченко и др., 1993). Доминирующей группировкой (>90% от числа бактерий, учитываемых на использованной среде) являлись грамположительные бактерии, представленные родами Bacillus, Rhodococcus, Micrococcus и Arthrobacter, в то время как грамотри-цательные, представленные родами Cytophaga и Spirillum хотя и выделялись, но в минимальных количествах.
Численность грибных зачатков в буром угле (среда Чапека) составила 8 х 103 КОЕ/г, что значительно ниже, чем в верхних горизонтах почв, где численность грибов колеблется в пределах 105-106 КОЕ/г (Марфенина, 2005). Выделялись представители двух родов: Penicillium и Trichoder-ma. Пенициллы были представлены видом P. jan-czewskii, для которого характерно обитание в сухих бедных органикой труднодоступных субстратах (Марфенина, 2005).
Поскольку показатели численности бактерий в буром угле, полученные прямым методом, были значительны, а метод посева давал
ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИOЛOГИЧECKAЯ < 2 2007
lg N 8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
3-й Сутки
14-е
Рис. 1. Изменение общей численности бактерий кл./г) в препарате бурого угля (окраска акридином оранжевым).
тыс. КОЕ/г 100
80
60 40
20
Суткй
Рис. 2. Изменение численности и таксономического состава бактерий при росте на глюкозо-пептонно-дрожжевой среде: 1 - Rhodococcus sp.; 2 - Arthrobacter sp.; 3 - Micrococcus sp.; 4 - Bacillus sp.
Длина, м/г 4
3-й Сутки
14-е
Рис. 3. Изменение длины грибного мицелия в препарате бурого угля (окраска акридином оранжевым).
тыс. КОЕ/г субстрата 200
150 100
50 0
1_.
3-й Сутки
14-е
Рис. 4. Изменение численности и таксономического состава микроскопических грибов при росте на среде Чапека: 1 - Trichoderma sp.; 2 - РетсШшт sp.
0
0
1
0
0
0
низкие величины численности, интересно было узнать, в каком физиологическом состоянии находятся эти микроорганизмы. О потенциальной активности микроорганизмов судили по выделению диоксида углерода, оцененного га-зохроматографическим методом. Так, интенсивность дыхания микроорганизмов бурого угля составила около 55.0 нМСО2/(см3 сут), что значительно меньше, чем в почве, где скорость эмиссии СО2 составляет
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.