ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 455-459
УДК 579.68.023.12:577.213:50445.06
МИКРООРГАНИЗМЫ ОЗЕР БАЙКАЛ И ИЬЯСА КАК ИНДИКАТОРЫ АНТРОПОГЕННОГО ВЛИЯНИЯ И ПЕРСПЕКТИВА ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ
© 2004 г. В. А. Верхозина*, Е. В. Верхозина**, Д. А. Гончар***, В. С. Дедков***,
С. X. Дегтярёв***, Ю. С. Куснер*
*Институт геохимии им. А.П. Виноградова СО РАН, Иркутск, 664033;
e-mail: verhval@igc.irk.ru **Институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Иркутск, 664003 ***ООО "СибЭнзим", Новосибирск, 630117; e-mail: gonchar@sibenzyme.ru Поступила в редакцию 05.06.2003 г.
В 650 штаммах, выделенных из водной толщи и донных осадков глубоких рифтовых озер мира Байкал (Россия) и Ньяса (Юго-Восточная Африка), выявлены эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). Изучение спектра ферментов рестрикции бактериальных штаммов позволило выявить наличие уникальных (Fan I, Aca I, Sse 91), а также весьма редких, не типичных для водных экосистем ферментов (Bsi I, Cci N I). В чистых участках водной толщи, в кернах глубинного бурения и донных отложениях Байкала и Ньясы обнаружены только известные ферменты рестрикции. Полученные результаты дают основания полагать, что в прибрежной части Байкала, находящейся под антропогенным влиянием, могут появляться мутантные штаммы бактерий с неизвестными ранее рестриктазами.
Поиск новых штаммов-продуцентов рестрик-таз проводится среди микроорганизмов, выделенных из различных природных изолятов. Эти ферменты широко используются в решении прикладных задач и служат объектом фундаментальных исследований, касающихся белок-нуклеиновых взаимодействий [1-4]. Актуальным также является изучение условий биосинтеза рестриктаз в природных изолятах. Водные микроорганизмы, как возможные продуценты рестриктаз мало изучены, хотя среди них выявлены ферменты с новой специфичностью [5, 6]. Среди микроорганизмов уникальной экологической ниши - Байкала -впервые обнаружены и идентифицированы новые продуценты рестриктаз, выделенные в районах антропогенного влияния [7].
Исследователи давно пытаются найти способ выявления влияния человека на экосистемы, в частности на водные объекты. Научные исследования, проводимые ранее на Байкале и относящиеся к поиску антропогенных влияний на озеро, касались количественных и качественных характеристик различных гидробионтов, в том числе и микроорганизмов [8]. Основное внимание уделялось количественному распределению бактерио-планктона в водной толще и грунтах озера. До сих пор не обсуждалось качественное изменение бактерий. Вероятно, использование традиционных методов исследований - микроскопии и изучения физиолого-биохимических признаков не давало таких возможностей. Мы попытались объеди-
нить традиционные методы исследований в лимнологии с методами физико-химической биологии: при помощи внутриклеточных ферментов рестриктаз дать характеристику бактерий, которые являются продуцентами этого фермента.
Цель работы - поиск и идентификация новых наиболее перспективных штаммов, выделенных из различных экологических ниш пресноводных озер Байкал и Ньяса, а также исследование влияния антропогенного фактора на биосинтез рестриктаз штаммов-продуцентов.
МЕТОДИКА
Пробы донных отложений из озер Байкал и Ньяса отбирали с разных глубин водной толщи (до 1200 м) в районах антропогенного влияния и в чистых фоновых районах. Пробы воды засевали методом глубинного посева, донные отложения -методом предельных разведений. В качестве питательной среды использовали мясопептонный агар. Культивирование бактерий проводили при температуре 22°С в течение 48 ч. Выросшие колонии отсевали в пробирки на поверхность питательного агара, инкубировали 20 ч при 25°С. Культуры идентифицировали по Берги [9]. Для поиска рестриктаз бактерии пересевали на другую чашку Петри с питательным агаром и выращивали ночь при 22°С. Колонии, в которых обнаруживали рестриктазную активность, рассевали штрихом для получения клонов и их последующего
исследования. Медленно растущие культуры выращивали 2 сут при 30°С. Свежую культуру, выращенную на агаре, собирали при помощи петли и засевали питательный бульон 100 мл в колбе на 500 мл. Выращивали в течение ночи при 30°С при 130 об/мин. Затем 10 мл ночной культуры вносили в другую колбу с бульоном и продолжали выращивание. Для исследования культуры отбирали пробы по 4 мл с интервалом 2 ч. Оптическую плотность определяли на фотоэлектроколориме-тре в кювете толщиной 1 см. Клетки центрифугировали из 1 мл среды 3 мин. Супернатант отбирали, а осадок замораживали при 20°С для последующего определения в нем удельной активности рестриктаз. Для наработки биомассы 400 мл ночной культуры засевали 4 л бульона, использовали ферментер Ultroferm 1601 ("LKB", Швеция). Культивирование проводили в течение 24 ч, при 30°С, аэрация 4 л/мин, перемешивание при 200 об/мин. Рост контролировали по оптической плотности. При замедлении роста клетки осаждали при 8000 g в течение 20 мин при 4°С. Биомассу хранили при -20°С.
Наличие рестриктаз определяли, как описано ранее [10, 11] с некоторыми модификациями. Поиск рестриктаз в колониях микроорганизмов проводили в агаровых культурах после экспозиции 12 ч. Для лизиса переносили 1 мг клеток в 100 мкл смеси, содержащей 10 мМ трис-НС1-буфер, pH 8.0, 1 мМ ЭДТА, 0.1%-ный тритон Х-100 и 0.1 мг/мл лизоцима ("Serva", Германия). Клетки суспендировали и инкубировали 30 мин при 22°С. Для выявления рестриктазной активности в лизат добавляли 10 мкл смеси, содержащей 1 М трис-НС1-буфер, рН 8.0, 0.5 М NaCl и 0.1 М MgC12. Затем перемешивали, отбирали 50 мкл и смешивали с субстратной ДНК 500 мкг/мл dam ДНК фага L 1857 (производства НПО "Фермент" Вильнюс) в 10 мМ трис-НС1-буфера, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА. Обе смеси инкубировали 2 ч при 37°С. Гидролиз ДНК прекращали добавлением в них по 10 мкл смеси, содержащей 0.3 М Na-ЭДТА, рН 8.0, 50%-ную сахарозу и 0.2%-ный бромтимоловый синий. Электрофорез фрагментов ДНК проводили 1.5 ч при 150 В в горизонтальной пластине (20 х 20 х 0.5 см с 4 рядами по 48 ячеек) геля 1%-ной агарозы. Электродный буфер (рН 8.0) содержал (г/л): трис - 10.8; Н3ВО3 - 5.5; ЭТДА - 0.93 и этидиумбромид - 0.001. Гель фотографировали под ультрафиолетом через красный светофильтр на пленку "Микрат-Н". Колонии микроорганизмов, лизаты которых специфически фрагменти-ровали ДНК, рассевали на питательном агаре для последующего изучения чистых культур.
В целях дополнительной проверки выявленных рестриктаз проводили гидролиз субстратной ДНК в серии разведений лизата в реакционной смеси по схеме определения удельной активности рестриктазы. Лизаты агаровых культур исполь-
зовали для определения оптимальной ионнои силы. Смесь, состоящую из 50 мМ трис-ИО-буфе-ра; рН 8.0; 10 мл MgC12; 50 мкг/мл ДНК фага L и 10 мкл лизата, распределяли по 20 мкл и добавляли 3М KCl до концентрации 0, 6, 12, 25, 50, 100, 200 и 400 мМ. Пробы инкубировали 2 ч при 37°С и анализировали методом электрофореза. Оптимальную концентрацию соли определяли по степени частичного расщепления ДНК. Для очищенных препаратов рестриктаз оптимальные условия активности определяли по следующим параметрам: рН и концентрация буфера, NaCl, KCl, MgC12, мер-каптоэтанола, триптона Х-100, температура. Предварительно определяли оптимум концентрации NaCl при 37° и 50°С, затем проводили оптимизацию по остальным параметрам при небольшой (10 мМ) концентрации MgCl2.
В качестве препаратов рестриктаз использовали как очищенные ферменты, так и лизаты клеток. Во втором случае брали определенное количество клеток, осажденных из жидкоИ питательной среды или собранных с твердоИ среды. В зависимости от продуктивности штамма клетки лизировали при плотности от 2 до 20 мг/мл. Полноту лизиса оценивали по просветлению суспензии (оптическая плотность уменьшалась в 10 раз и более), а также по вязкости лизата. При разрушении клеток, ус-тоИчивых к лизису, концентрацию лизоцима увеличивали до 1 мг/мл, а время лизиса - до 3 ч. Затем к 100 мкл лизата добавляли 10 мкл концентрированной смеси, содержащей ион магния и оптимальную для активности рестриктаза концентрацию ионов калия или натрия. После 60 мкл отбирали и смешивали с 3 мкг ДНК фага L в 6 мкл. Эту смесь использовали для 4-16 последовательных двукратных разбавлениИ в пробах по 30 мкл, содержащих 50 мкг/мл субстратной ДНК в рестрик-ционном буфере. После инкубации 2 ч при 37°С проводили электрофорез проб. Идентичная фрагментация ДНК более чем в 2 разбавлениях расценивалась как полныИ специфический гидролиз субстрата. Зависимость полного и частичного гидролиза от концентрации фермента в реакци-онноИ смеси использовалась как калибровочная электрофореграмма. Аналогичным образом определяли активность очищенных ферментов. Единицу активности рассчитывали как количество рестриктазы, достаточное для полного гидролиза 1 мкг ДНК фага L за 1 ч в оптимальных условиях. Удельную активность рассчитывали как отношение активности к 1 г биомассы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Из различных экологических ниш: водной толщи до придонного слоя (1200 и 700 м), донных осадков и кернов глубинного бурения озер Байкал (Россия) и Ньяса (Юго-Восточная Африка) выделили 650 штаммов бактерий, растущих на
h "à
M ]
ш
богатых средах. Все штаммы были проанализированы на наличие в них эндонуклеаз рестрикции.
Среди них выявлены микроорганизмы, дающие специфическую фрагментацию ДНК (рисунок). Как видно из рисунка, на восьмой дорожке нанесен лизат бактерии, продуцирующей фермент - изошизомер рестриктазы Clal (сайт узнавания ATCGAT). Штамм относится к виду Pseudomonas gladioli, а фермент, продуцируемый им, называется Pga 1, согласно общепринятой номенклатуре.
Определение остальных микроорганизмов, лизаты которых расщепляют ДНК, позволило отнести их к видам Flavobacterium aquatil, Hafnia alvei, Acinetobacter calcoaceticus. Ферменты названы соответственно: Fan 1, Hal 1, Hal 11, Aca 1. Предварительный анализ субстратной специфичности этих рестриктаз с помощью сопоставления картин гидролиза ДНК фага L Cl 857 с рассчитанными теоретически для различных ферментов [12] показал, что Hal 1 и Hal 11 являются, по-видимому, изошизоме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.