БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.5, c.772-777
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 576.323.2
МИОЗИНАКТИВИР УЮЩИЕ ПР ОТЕИНКИНАЗЫ В МИОКАР ДЕ ЧЕЛОВЕКА: ЛОКАЛИЗАЦИЯ И СОДЕРЖАНИЕ
© 2008 г. О.В. Степанова, А.В. Чадин, А.А. Раевская, Д.А. Бледжянц*, P.M. Муратов**, В.П. Ширинский
Институт экспериментальной кардиологии, Российский кардиологический научно-исследовательский комплекс,
121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, 15 а;
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, ПущиноМосковской области;
**Научный центр сердечно-сосудистой xирургии им. А .Н. Бакулева PАМН, 121552, Москва
Поступила в p едакцию 06.05.08 г.
C помощью иммунофлуоресцентного окр ашивания кр иосрезов миокарда человека нами было установлено, что недавно обнаруженные новые протеинкиназы, способные фосфорилировать миозин, такие как ROCK (RhoA-активируемая киназа), ILK (интегрин-ассоциированная ки-наза), ZIPK (киназа, связывающаяся лейциновой молнией) и DAPK (киназа, ассоциированная с апоптозом) локализуются в Z-дисках саркомер ов. Дополнительно было исследовано содержание ILK и ZIPK в образцах эмбр ионального миокарда, сердца здоровых взрослых людей и пациентов с патологической гипертр офией миокарда. Содержание ILK и ZIPK в нормальном миокарде взрослого человека выше, чем в эмбриональном, и еще больше увеличивается при гипертрофии миокарда. Полученные данные позволяют предположить участие этих протеин-киназ в развитии и гипертр офии миокарда.
Ключевые слова: RhoA-активируемая киназа; интегрин-ассоциированная киназа; киназа, связывающаяся лейциновой молнией; киназа, ассоциированная с апоптозом; кардиомиоциты; гипертрофия.
В кардиомиоцитах высших позвоночных экспрессируются саркомерный миозин, основной сократительный белок этих клеток, и немышечный миозин II типа В (ЧМПВ). КМПВ входит в со став пр едшественников миофибрилл и участвует в саркомерогенезе в пр оцессе формирования сократительного аппарата кардио-миоцитов. В зрелых постнатальных миофиб-риллах он локализуется в 2-дисках сар комер ов [1,2]. Оба белка подвергаются фосфорилирова-нию, которое регулирует их сократительные функции. Фосфорилирование саркомерного миозина приводит к увеличению силы сокращения (положительный инотропный эффект; [3]). Фосфорилирование немышечного миозина необходимо для активации его моторного домена и сборки миозиновых мономеров в фи-ламенты. КМПВ может быть фосфорилирован гладкомышечной/немышечной киназой легких
Сокращения: NMIIB - немышечный миозин II типа, КЛЦМ - киназа легких цепей миозина, ROCK - RhoA - активируемая киназа, ILK - интегрин-ассоциированная киназа, ZIPK - киназа, связывающаяся лейциновой молнией, ДАPК - киназа, ассоциированная с апоптозом, ДКМП - дилатационная кардиомиопатия, ФСБ - фос-фатно-солевой буфер, ГАФД - глицеральдегидфосфатдеги-дрогеназа.
цепей миозина (КЛЦМ) и скелетной КЛЦМ. Саркомерный миозин, скорее всего, не фосфо-рилируется гладкомышечной/немышечной
КЛЦМ, так как эта киназа имеет к нему низкое сродство [4] и располагается в Z-дисках кар-диомиоцитов, т. е. достаточно далеко от своего потенциального субстрата [2]. В то же время скелетная КЛЦМ не может являться универсальным регулято ром этого миозина в сердце, поскольку она не экспрессируется в миокарде некоторых видов животных [5]. Таким образом, остается открытым вопрос о том, какие протеинкиназы фосфор илир уют саркомерный и немышечный миозины в сер дце.
В последние годы идентифицирован ряд новых протеинкиназ, способных, как и киназа легких цепей миозина, фосфорилировать и активировать миозин. К ним относятся RhoA-ак-тивируемая киназа (ROCK), интегрин-ассоции-рованная киназа (ILK), киназа, связывающаяся лейциновой молнией (ZIPK), киназа, ассоциированная с апоптозом (DAPK). ROCK и ZIPK могут также фосфорилировать и инактивиро-вать фосфатазу легких цепей миозина, что пр и-водит к увеличению моторной активности миозина. Помимо миозина у всех вышеперечисленных киназ выявлены и другие субстраты [6,7].
МИОЗИНАКТИВИРУЮЩИЕ П РОТЕИНКИНАЗЫ В МИОКАРДЕ ЧЕЛОВЕКА 773
Участвуя в p азличных сигнальных каскадах, миозинактивир ующие протеинкиназы могут реализовывать специфические функции на всех этапах развития и функционирования сердца. Есть данные, что они вовлечены и в патологические процессы, такие как дилатационная кар диомиопатия (ДКМП) и гипер тр офия миокарда [8-10].
Гипертрофия миокарда - это адаптивный ответ сердечной ткани на гемодинамическую нагр узку или иной стресс, который может перейти в патологический процесс и привести к нарушению кровообращения. Среди р азных причин, вызывающих гипертрофию, называют и мутации в генах саркомерных белков, нарушающие их функциональные свойства, в том числе, способность миозина фосфорилировать-ся. Так, выявлено, что мутация гена регулятор-ных легких цепей сар комер ного миозина вблизи участка фосфорилирования вызывает гипертрофию сер дца у пациентов, которые наследуют мутантную аллель [11]. Установлено, что гипер тр офия миокарда сопровождается частичным возвратом к эмбриональному профилю экспрессии белков, среди котор ых а-гладкомы-шечный актин, немышечный миозин, киназа легких цепей миозина. Как известно, эти белки участвуют в эмбриональном периоде в процессах саркомерогенеза, который заново активируется при гипертрофии постнатального мио-кар да. Вер оятно, молекуляр ные механизмы сар-комер огенеза пр и гипертрофии сходны с таковыми при эмбриональном миофибриллогенезе. Одним из важнейших этапов сар комер огенеза является конверсия премиофибрилл в сар коме-росодержащие миофибриллы и замена немы-шечных/гладкомышечных белков в их составе на сар комер ные варианты. Фосфорилирование немышечного миозина является непременным условием успешной конверсии. В экспериментах на культуре кар диомиоцитов крыс было показано, что при ингибировании КЛЦМ наблюдается торможение саркомерогенеза [12]. Таким образом, фосфорилирование миозинов кардио-миоцитов может играть ключевую роль как в пр оцессе развития сер дца, так и при гипертрофии миокар да. В последнее время появляются данные об участии ROCK в этих процессах. Так, было показано, что специфическое инги-бирование ROCK нарушает формирование сердечных камер и трабекул у культивируемых эмбрионов мыши [13]. Постоянное ингибиро-вание ROCK может предотвращать процесс гипер тр офии кардиомиоцитов, вызванной ангио-тензином II у крыс [9]. Однако практически нет данных о других протеинкиназах, способных фосфорилировать и активировать миозин.
Целью данной работы было установление локализации ROCK, ILK, ZIPK и DAPK в кар-диомиоцитах человека и сравнение их содержания в нормальном эмбр иональном и взрослом сердце, а также в патологически гипертрофированном миокарде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Pеактивы и антитела. В работе были использованы биохимические реактивы аналитической чистоты фирм Sigma (CША), Serva (Германия), Fluka (Швейцария), Реахим (Россия), Fisher (США), Bio-Rad (США).
Были использованы антитела к ROCK-2 изоформе (Bethyl, США), ZIPK (eBiostie^e, США), ILK (BD Biosciences, США), DAPK (Santa ^uz Biote^nology, США). Антитела к глицеральдегидфосфатдегидрогеназе (ГАФД) были любезно предоставлены D. Watterson (NWU, ^idgo, США).
Материал миокарда человека. И сследование проводили на образцах гипертрофированной папиллярной мышцы, полученных в ходе хирургических операций пациентов с митральным пороком сердца. Ткани были заморожены в жидком азоте и использовались для приготовления образцов для электрофореза. Образцы эмбрионального сердца человека были любезно пр едо ставлены Dr. S.B. Marston (National Heart and Lung Institute, Imperial Allege, London, United Kingdom). Контролем служили образцы миокарда левого желудочка от шести здоровых людей, погибших от чер епно-мозговой тр авмы.
Приготовление образцов тканей для электрофореза. Замороженную ткань растирали в фарфоровой ступке в жидком азоте с 10 весовыми объемами буфера А (20 мМ трис-Hd рН 7,5, 0,5 мМ EGTA, 1 мМ диизопропилфторо-фосфата (ДФФ) и 10 объемами 3X буфера образца для электрофор еза [23]. Суспензию кипятили 5 мин, пропускали 10 раз через иглу шприца и осветляли в микроцентрифуге при 12000 об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость фасовали в аликвоты и замораживали при -20°С.
Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофор ез проводили по методу Laemmli [23]. В зависимости от задач использовали 5 - 12% гели со стандар тной и повышенной сшивкой.
Иммуноблоттинг проводили по методу Towbin [24] с использованием PVDF мембран фирмы Mil^ore (С ША) в трис-глицин/этано льном буфере.
Фильтры отмывали в фосфатно-солевом буфере (Ф СБ), блокировали 5% раствором обез-
Рис. 1. Локализация миозинактивирующих протеинкиназ ROCK, ILK, ZIPK и DAPK в кардиомиоцитах человека. (а) - Окрашивание анителами к ROCK (1), ILK (2), DAPK (3) (верхняя панель). Окрашивание антителами к а-актинину (нижняя панель). Линией указана солокализация протеинкиназ c а-актинином; (б) -окрашивание антителами к ROCK (1), ILK (2), DAPK (3), ZIPK (4); окрашивание на актин (нижняя панель). Линией указана локализация протеинкиназ в середине I-диска.
жиренного молока в Ф СБ c 0,2% твином 20. И спользовали специфичные первичные антитела (1 - 4 мкг/мл), втор ичные антитела, конъ-югир ованные с пероксидазой хрена и хемилю-минесцентный субстрат для детекции сигнала (Amersham, Великобритания).
Обработка результатов. Пленку с полученными сигналами сканир овали с помощью программы Epson 8сап II и обрабатывали с помощью программы Stion Image. Полученные результаты статистически обрабатывали с использованием программ Microsoft Е хсе1 и Graph Pad Prism 4, уравнивая значения активности киназ по ГАФД. Данные были представлены как средние значения со стандартными отклонениями.
Иммунофлуоресценция. К риоср езы образцов миокарда человека обрабатывали ацетоном в течение 20 мин при температуре -20°С. Далее ср езы обр абатывали фетальной телячьей сывороткой в течение 30 минут при комнатной температуре для предотвращения неспецифического окр ашивания. После этого ср езы инкубировали с первичными антителами в соответствующих разведениях. После промывания в фосфатно-солевом буфере срезы инкубировали с вторичными ан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.