ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 1, с. 88-98
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ РЕТРОГРАДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ЖР101 АгаЬ1йорБ1Б гкаИапа ПРИ ТЕПЛОВОМ СТРЕССЕ И ДЕЙСТВИИ АМИОДАРОНА
© 2014 г. Д. В. Пятрикас, Е. Г. Рихванов, И. В. Федосеева, Н. Н. Варакина, Т. М. Русалёва, Е. Л. Таусон, А. В. Степанов, Г. Б. Боровский, В. К. Войников
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений
Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск Поступила в редакцию 24.10.2012 г.
Тепловой стресс вызывает у растений повышение потенциала на внутренней митохондриальной мембране (мтДу), что сопровождается активацией экспрессии белков теплового шока (БТШ, или Н$Р). Обработка амиодароном (АМД) клеток Saccharomyces еегеу1$1ае приводит к параллельному повышению уровня Са2+ в цитозоле ([Са2+]цит) и мтДу, а также к индукции синтеза №р104. Предположили, что причиной гиперполяризации является повышение [Са2+]цит. В настоящей работе изучали эффект АМД (0—100 мкМ) на жизнеспособность, экспрессию БТШ, мтДу и [Са2+]цит, используя культуру клеток ЛгаЫйорш ЛаНана (Ь.) НеупЬ. Обработка АМД приводила к увеличению [Са2+]цит, что сопровождалось повышением мтДу и активацией экспрессии гена ИБР101. Повышение [Са ] цит и экспрессия ИБР101 наблюдались также при обработке протонофором СССР (карбо-нил-цианид(т-хлорфенил)гидразоном, 4 мкМ), снижающим мтДу. Полученные данные указывают на то, что митохондрии растительной клетки, изменяя потенциал на внутренней митохондри-альной мембране, модулируют содержание Са2+ в цитозоле и таким образом участвуют в ретроградной регуляции экспрессии ИБР101.
Ключевые слова: Arabidopsis thaliana — культура клеток — амиодарон — митохондрии — HSP101 — термотолерантность
DOI: 10.7868/S0015330314010114
Введение
Митохондрии обладают собственной генетической системой, однако большинство митохон-дриальных белков кодируется ядерной ДНК, синтезируется на цитоплазматических рибосомах и транспортируется в митохондрии [1]. Такое генетическое разделение труда требует четкой координации между двумя генетическими системами. Ядерный геном контролирует биогенез и функционирование митохондрий в результате процес-
Сокращения: АМД — амиодарон (2-бутил-3-(3,5-дийод-4-ди-этиламиноэтоксибензоил)-бензофуран); БТШ — белки теплового шока (или HSP — от heat shock protein); мтДу — потенциал на внутренней митохондриальной мембране; ПИ — пропидия иодид; ТТХ — 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида; ФДА — флуоресцеин диацетат; [Са2+]мит — уровень мито-хондриального Ca2+; [Са2+]цит — уровень цитоплазматиче-ского Ca2+; СССР — карбонил-цианид(т-хлорфенил)гидра-зон (от carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone); JC-1 — 5,5',6,6'-тетрахлор-1,1',2,2'-тетраэтилбензимидазолокарбо-цианин.
Адрес для корреспонденции: Пятрикас Дарья Валерьевна. 664033 Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Электронная почта: galdasova@sifibr.irk.ru
са, получившего название антероградная регуляция [1, 2]. Нарушение функционирования митохондрий в результате мутаций или обработки митохондриальными ингибиторами может влиять на экспрессию ядерных генов. Этот процесс известен как митохондриальная "ретроградная" регуляция [1, 2]. Однако природа сигнала, с помощью которого митохондрии участвуют в этом процессе, остается неизвестной. Предполагается, что митохондрии, модулируя продукцию активных форм кислорода (АФК) и концентрацию ионов Са2+ в цитозоле, регулируют экспрессию ядерных генов [1].
Известно, что повышение температуры, а также другие стрессовые воздействия вызывают кратковременное повышение уровня Са2+ в цитозоле ([Са2+]цит) растительной клетки и усиление продукции АФК, что активирует экспрессию стрессовых генов, в том числе и генов белков теплового шока (БТШ или Н8Р) [3]. Кроме того, показано, что митохондрии растений участвуют в гомеостазе внутриклеточного кальция [4, 5] и являются одним из источников генерации АФК [6].
Эти результаты дают основание предполагать, что митохондрии, модулируя генерацию АФК и уровень [Са2+]цит, участвуют в активации экспрессии генов БТШ и при повышении температуры. Так, у клеток АгаЫйор$15 ЛаНапа после обработки бактериальным элиситором харпином нарушение ми-тохондриальных функций приводило к активации экспрессии БТШ [7]. Аналогичный эффект наблюдался у растений при аноксии [8], а также в результате мутаций, нарушающих функционирование митохондрий [9, 10].
Ранее мы показали, что предварительное мягкое тепловое воздействие, активирующее экспрессию БТШ, вызывало повышение потенциала на внутренней митохондриальной мембране (мтДу) в клетках Баеекаготуеез оегеу181ае [11] и А. ЛаНапа [12]. Подобное явление описано для культуры клеток млекопитающих [13]. При этом агенты, способные при подобных экспериментальных условиях подавлять мтДу, подавляли также и активацию экспрессии БТШ [11, 12]. Полученные результаты указывают на то, что при действии теплового стресса повышение мтДу является необходимым условием для активации экспрессии БТШ [11—13]. Вероятным следствием повышения мтДу является усиление продукции АФК [14], что, в свою очередь, активирует экспрессию генов БТШ [3].
На настоящий момент причины митохондри-альной гиперполяризации при тепловом стрессе у растений до конца не выяснены. Однако известно, что у растений [5] и животных [15] повышение [Са2+]цит приводит к параллельному повышению уровня Са2+ в митохондриях ([Са2+]мит). В клетках животных при их обработке вазопрессином повышение [Са2+]мит стимулирует активность дегид-рогеназ цикла Кребса. Дегидрогеназы, в свою очередь, активируют транспорт электронов по дыхательной цепи, что, соответственно, приводит к повышению мтДу [15]. Очевидно, то же самое правило справедливо для клеток животных и при тепловом воздействии. Так, при повышении температуры выявлена положительная зависимость между повышением [Са2+]цит, мтДу и индукцией синтеза Шр70 [13]. На основании этих результатов было высказано предположение, что повышение мтДу, наблюдаемое в клетках 8. сеге-у1$1ае [11] иA. thaliana [12] при действии теплового стресса, является следствием повышения
[Са +]цит.
Зависимость между [Са2+]цит, мтДу и активацией экспрессии генов БТШ была подтверждена при изучении реакции клеток S. ceгevisiae на обработку амиодароном (АМД). Ранее было показано, что АМД вызывает в клетках S. ceгevisiae повышение [Са2+]цит [16], мтДу [17] и индукцию синтеза Шр104, а также повышение термотолерантности
[18]. Хотя очевидно, что митохондрии растительной клетки активно участвуют в гомеостазе внутриклеточного кальция [4, 5], остается неизвестным, как повышение [Са2+]цит влияет на изменение мтДу у растений. Поэтому целью настоящей работы являлось изучение зависимости между уровнем [Са2+]цит, мтДу и активацией экспрессии генов БТШ при обработке АМД и действии теплового стресса в культуре клеток A. thaliana. Поскольку нарушение функционирования дыхательной цепи, как правило, деполяризует мито-хондриальную мембрану, что может приводить к активации экспрессии генов БТШ растений в отсутствие теплового стресса [7, 8, 18], а также к повышению [Са2+]цит [4], в качестве дополнительного контроля использовали протонофор СССР (от carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone), который эффективно снижает мтДу.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали культуру клеток Arabi-dopsis thaliana (L.) Heynh (раса Columbia), полученную из 14-дневных проростков, выращенную в темноте при 26°С в МС-среде, содержавшей 3% сахарозы, 0.5 мг/мл тиамина хлорида и 0.1 мг/л 2,4-Д. Культуру пересевали каждые 14 дней на шестикратно разведенную свежую среду. Для экспериментов использовали 8-дневную культуру, что соответствовало второй половине логарифмической фазы роста, которая характеризуется наибольшей физиологической активностью клеток и наименьшим конститутивным уровнем синтеза БТШ.
Для изучения влияния амиодарона (АМД) на жизнеспособность клеток культуру рассевали по 5 мл в конические колбы объемом 50 мл и инкубировали при 26° или 37°С 120 мин в присутствии или в отсутствие АМД (0—100 мкМ). Для изучения влияния АМД (50 мкМ) и СССР (4 мкМ) на термотолерантность клетки инкубировали при 26° или 37°С 120 мин в присутствии этих агентов. Затем клетки несколько раз промывали МС-сре-дой для удаления исследованных веществ, ресус-пендировали в свежей МС-среде и инкубировали при 26°С в течение 120 мин. После этого клетки подвергали действию повреждающего теплового шока (50°С, 10 мин).
Выживаемость клеток суспензионной культуры определяли через 48 ч последующей инкубации при 26°С по восстановлению 2,3,5-трифени-лтетразолия хлорида (ТТХ), который в живых клетках восстанавливается с образованием водо-нерастворимого формазана [19]. Образовавшийся формазан извлекали из клеток этанолом при 65°С в течение 15 мин. Спиртовой раствор фор-мазана колориметрировали при 490 нм на фото-электроколориметре ФЭК-46 (Россия). Экстинк-
Использованные ПЦР-праймеры
Символ Локус Длина ожидаемых ПЦР-продуктов, п.н. Последовательности ПЦР-праймеров
HSP101 at1g74310 1497 F: 5'-GAATGCAGGACATGCTCAAT-3' R: 5'-CAACGTTTTCTGTGAGCATCA-3'
HSP60 at3g23990 890 F: 5'-AGGGTGTTGAAGATCTTGCTG-3' R: 5'-ATTCATGCCAAGCTCGTCTGT-3'
HSP17.6CI at1g53540 652 F: 5'-AAAACAGAGCAAACGCAAAG-3' R: 5' - CACGAGACAAAGCACACTCTT- 3'
HSP17.6II at5g12020 325 F: 5' - GTGCTTGTGGTGAGTGGAGA- 3' R: 5'-ACACCATATCCCTCACGCAT-3'
25S rRNA 25S rRNA 550 F: 5'-GGGATTACCCGCTGAGTTTA-3' R: 5'-CGTCTCCACAAGCGTATCAA-3'
цию рассчитывали на 1 г сырой массы. Жизнеспособность также определяли по флуоресценции флуоресцеина диацетата (ФДА, 50 мкМ) и пропидия иодида (ПИ, 10 мкг/мл) после инкубирования клеток арабидопсиса в течение 2 мин с красителями [20].
Для изучения влияния АМД и СССР на содержание БТШ (HSP101, HSP70, HSP60, HSP17.6) клетки обрабатывали, как указано выше, промывали и хранили при —70° С до момента выделения белка. Клетки размораживали, ресуспендировали в буфере для выделения белка (0.1 М Трис—HCl, 3 мМ ДДС, 1 мМ Р-меркаптоэтанол, pH 7.4-7.6), замораживали в жидком азоте и растирали с кварце
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.