РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 1, с. 20-30
ОБЗОР
МНОГОЦВЕТНЫЙ ЦИТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ NK-КЛЕТОК
© 2008 г. С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка*
Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия;
* ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Росздрава,
Челябинск, Россия
Поступил: 27.12.07 г. Принят: 24.01.08 г.
Иммунофенотипирование с использованием многоцветного анализа особенно важно для характеристики высоко специализированных субпопуляций лимфоцитов, таких как клетки иммунологической памяти, антигенспецифические и регуляторные Т-клетки, дендритные клетки и субтипы NK-клеток. Оценка относительного количества NK-кле-ток является одним из важных диагностических признаков при иммунологических расстройствах. Наиболее полную характеристику относительного количества NK-клеток и их субпопуляционного состава можно получить при следующей комбинации монокло-нальных антител: CD3/CD16/CD56/CD45, CD3/CD8/CD38/CD45 и CD3/CD11a/ CD56/CD45. Применение многоцветного окрашивания и многоэтапного гейтирования позволяет провести многопараметрический анализ NK-клеток периферической крови с высокой точностью и достоверностью в одной пробе пациента. Данный подход значительно облегчает интерпретацию полученных результатов анализа и позволяет судить о функционировании иммунной системы больных при разнообразных патологических состояниях.
Ключевые слова: NK-клетки, иммунофенотипирование
введение
Процесс развития иммунного ответа организма сопровождается значительными изменениями субпопуляционного состава имму-ноцитов и их абсолютного количества. Это проявляется в появлении на клеточной поверхности определенных функциональных молекул.
Под фенотипом следует понимать совокупность функционально значимых маркеров, характерных для определенных стадий диф-ференцировки, пролиферации, активации или апоптоза лимфоцитов и других клеток. Конечным результатом иммунофенотипиро-вания является определение относительного и абсолютного количества клеток, имеющих один или несколько конкретных маркеров. Например, при инфекции ВИЧ по оценке
Адрес: 117997 ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Россия. E-mail: khsv@mail.ibch.ru
абсолютного содержания CD4+ Т-клеток определяется степень тяжести течения заболевания, что является одним из основных критериев прогноза и назначения антиретрови-русной терапии [1].
С течением времени методологические подходы к определению иммунофенотипа претерпели значительную эволюцию. Использование морфологических параметров (малоугловое светорассеяние — FS (forward scatter)), рассеяние света под углом 90° — SS (said scatter) для локализации пула лимфоцитов и одноцветный анализ оказались недостаточно информативны, так как ряд популяций лимфоцитов экспрессируют одни и те же маркеры. Более корректным был двухцветный анализ, но и он имеет свои недостатки, поскольку для локализации лимфоцитов по-прежнему использовали их морфологические особенности [2].
Возможность локализации лимфоцитов, опираясь на экспрессию пан-лейкоцитарного антигена CD45, многоцветный анализ (боль-
ше двух цветов) и многостадийное тестирование революционизировало использование метода проточной цитометрии при диагностике состояния иммунной системы и ее аномалий [3]. Иммунофенотипирование с использованием многоцветного анализа особенно важно для характеристики высоко специализированных субпопуляций лимфоцитов, таких как клетки иммунологической памяти, антиген-специфические и регулятор-ные T клетки, дендритные клетки и субтипы NK-клеток.
Разработка современных цитометров, позволяющих регистрировать больше чем четыре цвета, успехи в химии флуоресцентных красителей, открытие новых CD маркеров, усовершенствование программного обеспечения позволили проводить анализ фенотипа иммунокомпетентных клеток как рутинную процедуру и получать наиболее полную и достоверную информацию. Как следствие этого, разрабатываются новые подходы к коррекции активности, патологически измененных клеток и процессов, которые они определяют. К одной из наиболее важных популяций иммунокомпетентных клеток относятся NK-клетки. Мы сочли необходимым остановиться более подробно на возможности их локализации и более полной характеристике.
nk-клетки и их субпопуляции
Среди больших гранулярных лимфоцитов (LGL, Large Granular Lymphocytes) выделяют отдельную популяцию клеток, получившую название натуральных киллеров или NK-клеток (Natural Killer). NK-клетки являются важным компонентом врожденной иммунной системы за счет наличия цитолити-ческой активности против клеток мишеней и своей способности продуцировать цитокины [4]. Первоначально они были описаны именно на основании их функциональной способности уничтожать клетки некоторых опухолей гемопоэтического происхождения без предшествующей стимуляции [5]. Таким образом, одной из основных функций данной субпопуляции клеток является защита собственного организма от видоизмененного «своего».
Как уже было сказано выше, NK-клетки являются носителями двух основных функций. Первая — это лизис опухолей и инфицированных вирусами клеток [6, 7]. Вторая — регуляция врожденного и адаптивного им-
мунных ответов за счет секреции хемокинов (С^3, С^4, С^5 и ХОЛ) [8, 9] и цитокинов (ГМ-КСФ, ФНОа, и ИФНу) [4, 10].
Способность NK-клеток взаимодействовать и убивать опухолевые, но не нормальные, клетки была описана, а позже и объяснена рядом авторов [11, 12, 13]. Этот эффект происходит за счет нескольких специализированных рецепторов, распознающих молекулы МНС класса I, которые экспрессируют-ся на нормальных клетках [12]. Эти рецепторы формируются на NK-клетках при ассоциации молекул CD94 с молекулами семейства N^2 ^159) [14].
В свою очередь, NK-клетки являются субпопуляцией лимфоцитов наиболее чувствительной к физиологическим и психологическим стрессам [15, 16]. В настоящее время доказано выраженное воздействие высоких физических нагрузок на NK-клетки [16, 18]. Их цитолитическая активность увеличивается при нарастании физической нагрузки и уменьшается после ее окончания, обычно в течение нескольких часов. Это отражается главным образом на распределении NK-кле-ток с небольшими изменениями их цитоток-сической активности [15, 17, 19].
В периферической крови NK-клетки составляют от 5 до 20% циркулирующих лимфоцитов [20, 21]. По другим данным среди лимфо-идной популяции периферической крови человека NK-клетки составляют приблизительно 10—15% [22]. В таблице 1 приведены примеры взаимосвязи изменения активности и количества NK-клеток с клиническими признаками или увеличением риска заболеваний у людей [23]. Как видно из данной таблицы, относительное количество NK-клеток и их активность существенно изменяются не только при опухолевых процессах и вирусной инфекции, но и при гнойном воспалении, нарушении функций центральной нервной системы (ЦНС), аутоиммунных заболеваниях и т.д. Вероятно, что в результате применения более тонких и точных методов исследований, таких как проточная цитометрия и многопараметрический анализ, будут выявлены и другие изменения в субпопуляциях этих клеток при иных патологиях.
Поэтому мы сочли необходимым охарактеризовать основные и активационные маркеры NK-клеток, позволяющие оценить как всю популяцию натуральных киллеров, так и их основные субпопуляции.
Для локализации NK-клеток среди других лимфоцитов используют моноклональные ан-
Таблица 1. Примеры отклонений в активности и количестве ЫК-клеток, связанные с проявлением клинических признаков или увеличенным риском заболеваний у людей [23]
Изменение
количества и активности ЫК-клеток Патологическое состояние Ассоциированные симптомы и риски
Постоянно низкая активность и количество ЫК-клеток Приобретенный или врожденный иммунодефицит, включая СПИД Высокий риск возникновения онкологических заболеваний и достаточно частые инфекционные заболевания
Синдром Чедиака-Хигасси Повышенный риск образования лимфом
Дефицит CD11/CD18 молекул семейства клеточной адгезии Увеличенная восприимчивость к вирусным инфекциям
Онкологические заболевания Распространение метастазов
Онкологические заболевания, связанные с наследственностью Вероятность появления злокачественного образования выше нормального
Лейкемия Предшествует рецидиву
Х-связанный лимфопролиферативный синдром Повышенная чувствительность к вирусу Эпштейна-Бара
Рак молочной железы (при диагнозе) Неблагоприятный прогноз
Рак шеи и головы (до терапии) Неблагоприятный прогноз
Терапия цитостатиками Более высокая вероятность рецидива
Вирусная инфекция (цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Бара, вирус герпеса) Более высокая частота, серьезность, и продолжительность заболевания
Другие вирусные и бактериальные инфекции Более высокая частота, серьезность и продолжительность заболевания
Аутоиммунные заболевания Возможно более активное течение болезни, увеличенная частота инфекций
Психические расстройства
Синдром дефицита ЫК-клеток Усталость, сниженная восприимчивость, лихорадка
Синдром хронической усталости Повышенная утомляемость, апатичность, увеличенная частота вирусных заболеваний
Депрессия Более серьезные признаки
Хронический стресс Неспособность справляться с ежедневными проблемами, усталость
Постоянно высокая активность и количество ЫК-клеток Лимфопролиферация NK-клеток Хроническая пролиферация больших гранулярных лимфоцитов (LGL-пролиферация) Острая пролиферация больших гранулярных лимфоцитов (LGL-пролиферация) LGL лимфоцитоз, цитопения, спленомегалия Встречается совместно с активной лейкемией/лимфомой
Гепатит Нет данных
титела, распознающие различные маркеры, экспрессируемые на их поверхности. Однако многие поверхностные молекулы NK-клеток представлены и на других субпопуляциях лимфоцитов и это накладывает свои особенности на идентификацию натуральных киллеров. В связи с этим для их локализации среди других лейкоцитов используют уникальную комбинацию из нескольких маркеров, таких как, CD56 и CD16. С другой стороны, NK-клетки не экспрессируют такие линейные маркеры, как CD3, CD14 и поверхностные Ig и это также используется при их локализаци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.