— ОБЗОР
МНОГОЦВЕТНЫЙ ЦИТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ СУБПОПУЛЯЦИЙ В-КЛЕТОК
© 2007 г. С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка*
Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
Москва, Россия;
*ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Росздрава,
Челябинск, Россия
Поступил: 10.10.07 г. Принят: 26.10.07 г.
Гуморальный иммунный ответ играет критическую роль в устранении как внутриклеточных, так и внеклеточных патогенов. Этот процесс проистекает за счет дифференцировки зрелых В-клеток в плазматические клетки, которые секретируют большие количества антител. Оценка относительного количества В-клеток является одним из важных диагностических признаков. Наиболее полную характеристику относительного количества В-кле-ток и их субпопуляционного состава можно получить при следующей комбинации моно-клональных антител: С03/СШ9/С05/С045 и С03/СШ9/С027/С045. Применение многоцветного окрашивания и многоэтапного гейтирования позволяют провести многопараметрический анализ клеток периферической крови с высокой точностью и достоверностью в одной пробе от пациента. Данный подход значительно облегчает интерпретацию полученных результатов анализа и позволяет судить о функционировании иммунной системы больных при разнообразных патологических состояниях.
Ключевые слова: проточная цитометрия, многопараметрический анализ, В-клетки, СБ5, СБ27.
ВВЕДЕНИЕ
При оценке относительного количества и характеристике клеток, участвующих в иммунном ответе на антигены, очень важно иметь представление о всех типах клеток, вовлеченных в формирование специфического (адаптивного) иммунного ответа организма на внедрение патогена. При формировании иммунной реакции одна из ведущих ролей принадлежит клеткам тими-ческого происхождения Т-лимфоцитам. В то же время эффекторные механизмы специфической иммунореактивности обеспечиваются либо эффекторными Т-клетками (Т-эффекторы ГЗТ, цитотоксическими Т-клетками), либо специфическими гуморальными факторами — антителами, секретируемыми плазматическими клетками — потомками В-лимфоцитов.
В-КЛЕТКИ И ИХ СУБПОПУЛЯЦИИ
Основной формой мембранных иммуноглобулинов являются иммуноглобулины класса М. Они экспрессируются на мембране всех
Адрес: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10. Институт биоорганической химии. E-mail: khsv@mail.ibch.ru, khsergey54@mail.ru
зрелых В-клеток, которые не имели контакта с антигеном. Однако, на поверхности В-клеток, дифференцировка которых уже завершилась, присутствуют и иммуноглобулины класса Б. В процессе формирования иммунного ответа происходит переключение изоти-пов мембранных иммуноглобулинов на 1дС, 1дА, 1дЕ [2].
Кроме мембранных иммуноглобулинов В-клетки экспрессируют целый ряд мембранных маркеров, которые, во-первых, необходимы для формирования В-клеточного рецептора и играют важную роль в передаче сигнала в процессе распознавания антигена, а во-вторых, являются маркерами линейной принадлежности В-клеток, что особенно полезно при идентификации данной популяции лимфоцитов. К таким маркерам, прежде всего, относятся СБ 19 и СБ21. Данные молекулы формируют корецепторный комплекс, в который вовлечен также и СОБ1 [3].
СБ 19 антиген (также известный как В4) представляет собой мембранный гликопроте-ин с молекулярным весом 95 кДа. СБ19 вовлечен в регулирование развития В-лимфоцитов, активацию и их дифференцировку. Эта молекула экспрессируется на всех нормальных В-клетках, включая про-В-лимфоциты, но
исчезает у плазматических клеток в процессе их созревания. Молекула СБ 19 отсутствует на мембране нормальных Т-клеток, ЫК-кле-ток, моноцитов и гранулоцитов (Рис. 1). В связи с этим данный антиген рекомендуется использовать для количественной оценки общей популяции В-клеток [3].
СБ21 антиген представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 145 кДа. Он принадлежит к семейству белков, регулирующих активность комплемента. СБ21 (СИ2) является рецептором для C3d компонента комплемента и вируса Эп-штейна-Барра. Данный антиген присутствует на зрелых В-лимфоцитах и отсутствует на Т-лимфоцитах, гранулоцитах и моноцитах. Молекула СБ21 вовлечена в активацию В-лимфоцитов и их пролиферацию [3].
Кроме перечисленных выше структур в состав В-клеточного рецепторного комплекса входят и другие молекулы, такие как СБ20 и СБ22.
СБ20 антиген (Вр35) — интегральный не гликозилированный мембранный белок с четырьмя трансмембранными доменами. Встречаются три изоформы СБ20 (33, 35 и 37 кДа), которые являются результатом дифференциального фосфорилирования внутри цито-плазматических доменов. Данная молекула является Са2+-каналом и участвует в активации и пролиферации В-клеток за счет регуляции трансмембранной проводимости ионов Са2+. Молекула СБ20 присутствует на всех нормальных В-лимфоцитах периферической крови, лимфатических узлов, селезенки, миндалин и костного мозга, но отсутствует на плазматических клетках [3].
Некоторые исследователи для локализации В-клеток используют СБ20, но данная молекула может экспрессироваться в низкой плотности на других популяциях лимфоцитов. Хотя СБ20 первоначально был описан как В-клеточный линейный маркер, оказалось, что небольшая субпопуляция Т-клеток человека экспрессирует СБ20 в низкой плотности [4]. Причем, В-клетки экспресси-ровали СБ20 в высокой плотности (СВ20Ь"9М), а Т-клетки в низкой (СБ20Шт) и составляли 2,4±1,5% от лимфоцитов периферической крови.
Хотя оценка экспрессии СБ20 бывает полезна при характеристике В-клеток, необходимо достаточно осторожно подходить к интерпретации получаемых результатов (Рис. 2). Особенно это относится к случаям фенотипирования костного мозга [5]. Сход-
16,1% 0,1%
15,7% 68,0%
а.
а
и
С.Ш-РТТС
Рис. 1. Гистограмма распределения СБ3 и СБ19 на лимфоцитах периферической крови. СБ3-СБ19+ В-клет-ки (квадрант Л1), СБ3 + СБ19- Т-клетки (квадрант Л4).
Е?
а.
■
о
(N
о и
CD5-FITC
Рис. 2. Гистограмма распределения CD20 и CD5 на лимфоцитах периферической крови у пациента с ревматоидным артритом.
ная проблема может возникнуть при феноти-пировании периферической крови у пациентов с ревматоидным артритом [6].
Поскольку активация СБ20 приводит В-клетки к апоптозу [7, 8, 9], данная молекула послужила мишенью для терапии не-Ход-жкинских В-клеточных лимфом [10, 11, 12].
СБ22 антиген (BL-CAM) — трансмембранный гликопротеин, принадлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов. Данная моле-
СБ19-РГГС СБ19-ПТС
Рис. 3. Гистограмма распределения СБ5 и СБ19 на лимфоцитах периферической крови. Субпопуляции В-1 лимфоцитов у пациентов с аутоиммунным тиреоидитом: пациент А — до лечения; пациент Б — в процессе лечения.
кула экспрессируется в виде двух различающихся изоформ: а-форма (130 кДа) и Р-форма (140 кДа). СБ22 антиген экспрессируется в цитоплазме В-клеточных предшественников и на поверхности зрелых В-лимфоцитов. Экспрессия СБ22 исчезает после активации В-клеток, предшествующей стадии созревания плазматической клетки. Молекула СБ22 отсутствует на Т-лимфоцитах, гранулоцитах и моноцитах периферической крови [3].
В настоящее время среди В-клеток выделяют три основные субпопуляции, а именно: В-1, В-2 и, так называемые, В-клетки памяти. Достаточно важная роль при данном делении отводится молекуле СБ5 [13, 14].
СБ5 антиген представляет собой одноцепо-чечный трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 67 кДа. Внеклеточный домен содержит 3 рецепторных участка, богатых цистеином ^КСИ), приблизительно по 100 аминокислот каждый. Молекула СБ5 обнаружена на всех зрелых Т-лимфоцитах и на большинстве тимоцитов. СБ5 также присутствует на субпопуляции В-лимфоцитов, но отсутствует на гранулоцитах и моноцитах. Молекула СБ5 является лигандом для СБ72 антигена, который присутствует на В-летках [3]. Хотя точная функциональная роль СБ5 все еще до конца не изучена, для этих молекул была показана физическая ассоциация с ан-тигенспецифическим рецепторным комплексом как на Т-, так и на В-лимфоцитах и возможность модулировать передачу сигналов через этот комплекс [15, 16]. Однако в послед-
ние годы было показано, что СБ5 может быть посредником при негативной регуляции передачи сигналов для В-клеточного рецептора (ВСИ). Молекула СБ5 в нормальных В-1 клетках содержит фосфорилированый тирозин и специфически взаимодействует с SHP-1, домен SH2 которого обладает тирозин-фосфа-тазной активностью. Таким образом, СБ5 способствует длительному взаимодействию между ВСИ и SHP-1, что, в свою очередь, может ингибировать передачу сигналов для ВСИ [17, 18].
Кроме роли, связанной с передачей сигналов при активации, молекула СБ5 была расценена как возможный маркер В-клеток, позволяющий различать их субпопуляции: СБ5 + В-клетки (также называемые В-1 клетки) и обычные СБ5- В-клетки (или В-2 клетки) [13, 14].
В-1 клетки вызывают значительный интерес в силу того, что их ассоциируют с продукцией аутоантител [19, 20, 21], а также с аутоиммунными патологиями [22]. Значительная роль В-1 клеток была отмечена при ревматоидном артрите, системной красной волчанке и синдроме Шегрена [23, 24, 25]. Увеличение количества СБ5+ В-клеток наблюдали у пациентов, страдающих миастенией, инсулин-зависимым сахарным диабетом и тиреоидитом Хашимото [26]. На рисунке 3 представлены гистограммы распределения В-1 (СБ19 + СБ5 + ) и В-2 (СВ19+С05_) лимфоцитов при аутоиммунном тиреоидите. Как видно из рисунка, у пациента А. доля СБ5+ В-клеток составляла практиче-
ски треть от всех В-клеток, тогда как у пациента Б., в процессе лечения, их количество значительно снизилось и составляло приблизительно десятую часть от всех В-клеток. В таблице 1 приведен список заболеваний, при которых определение относительного уровня В-1 клеток является диагностически значимым.
Следующей субпопуляцией В-клеток, вызывающей значительный интерес у исследователей, являются так называемые В-клетки памяти. Определение СБ27 как маркера памяти В-клеток [27, 28, 29] позволило надежно и эффективно идентифицировать в периферической крови наивные В-клетки (1дМ+/СБ27-) и В-клетки памяти (СБ27 + ).
СБ27 антиген является трансмембранным гликопротеином. Он представлен в виде гомо-димера, сос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.