РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2007, том 1(10), № 3-4, с. 246-250
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
МОДЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗОВ ХИМИЧЕСКИХ КАНЦЕРОГЕНОВ
© 2007 г. А.Н. Глушков, М.В. Костянко*, Т.П. Аносова, Е.Г. Поленок, С.А. Мун, М.П. Аносов, С.В. Черно
Кемеровский научный центр СО РАН, Кемерово, Россия; *Кемеровский государственный университет, Кемерово, Россия
Поступила: 15.12.06 г. Принята: 26.10.07 г.
Целью настоящего исследования явилась разработка экспериментальной модели для определения иммунологических образов химических канцерогенов. Синтезированы конъю-гаты бензо(а)пирена, бенз(а)антрацена, антрацена, хризена и пирена с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и дрожжевой гексокиназой (НК). Иммунизировали кроликов конъюгатами на основе БСА. Из сыворотки выделяли антитела с помощью аффинных адсорбентов гаптен-НК-верЬагове 4В. Определили способность каждого из гаптенов к связыванию с каждым из антител с помощью конкурентного иммуноферментного анализа. Составлены иммунологические образы для исследуемых соединений. Данная модель предлагается для получения и скриннинга моноклональных антиидиотипических антител к химическим канцерогенам.
Ключевые слова: иммунологический образ, химические канцерогены, антитела
ВВЕДЕНИЕ
Ранее обсуждались новые подходы к иммунопрофилактике рака и других заболеваний, возникающих под действием химических канцерогенов [1]. Отмечалось, что наиболее подходящими кандидатами на роль вакцин против химических канцерогенов являются моноклональные антиидиотипические антитела (АТ). Они не содержат в своем составе канцерогенов и поэтому не способны индуцировать опухоль в месте введения. В то же время они несут в себе т.н. «внутренний иммунологический образ» канцерогена и поэтому способны индуцировать синтез соответствующих анти-канцерогенных АТ. В работах J.L. Chagnaud et al. [2, 3] показано, что моноклональные антиидиотипические АТ к бен-зо(а)пирену (Bp) тормозят появление и рост опухолей, индуцированных у животных. Однако, описанная методика получения таких АТ не дает представления о том, внутренний иммунологический образ какого именно соединения из группы полициклических ароматических углеводородов (PAH) отображен в этих АТ. Целью настоящего исследования явилась разработка экспериментальной модели для определения иммунологических об-
разов химических канцерогенов и описание иммунологических образов Вр, бенз(а)антра-цена (Ва), антрацена (Ас), хризена (Сг) и пирена (Р).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Синтез конъюгатов РАН-белок и аффинных сорбентов
Конъюгаты Ас, Ва, Вр, Сг и Р с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и дрожжевой гексокиназой (НК) были синтезированы по описанной ранее методике [4].
Для синтеза иммуногенов РАН-БСА к раствору 100 мг БСА в 1 мл 0,1 М гидроксида натрия и 1 мл пиридина добавляли раствор соответственно 17,5 мг Вр-6-; 14,6 мг Ва-7-; 11,7 мг Ас-9-; 16,0 мг Сг-6- или 10,2 мг Р-1-карбальде-гида в 1,5 мл пиридина. После 5 часов перемешивания добавляли раствор 7,5 мг борогидри-да натрия в 0,1 мл воды. Через 1,5 часа разлагали избыток восстановителя 50 мкл уксусной кислоты и осаждали белок 10 мл ацетона. Осадок многократно промывали ацетоном и высушивали под вакуумом. Полученные конъюгаты содержали 25±2 моль РАН на моль БСА. Аналогично проводили синтезы конъюгатов РАН-НК из 70 мг НК, 1 мл 0,06 М гидроксида натрия и соответственно 7,3 мг Вр-6-; 7,9 мг Ва-7-; 6,0 мг Ас-9-; 8,5 мг Сг-6- или
Адрес: 650025 г. Кемерово, ул. Рукавишникова, 21. E-mail: ihe@list.ru
6,1 мг Р-карбальдегида. На стадии восстановления конъюгатов борогидридом натрия дополнительно добавляли 50 мг акриламида.
Иммунизация животных
Кроликов иммунизировали конъюгатами РАН-БСА в мышцу бедра по следующей схеме. Три инъекции по 2 мг конъюгата каждую неделю: в 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда («Sigma»); в 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда («Sigma»); в 1 мл дистиллированной воды. Затем каждые 2 недели — поддерживающие инъекции по 1 мг конъюгата в 1 мл дистиллированной воды. Забор крови из краевой ушной вены выполняли 1 раз в 2 недели спустя 2 месяца после начала иммунизации.
Аффинная хроматография гипериммунных сывороток
Конъюгаты PAH-HK иммобилизовали на бромциан активированной Сефарозе 4B согласно рекомендациям фирмы Pharmacia. После нанесения антивыротки колонку отмывали PBS (pH 7,5), а затем элюировали связавшиеся АТ 0,1М глициновым буфером (pH 2,5). АТ ди-ализовали против ФСБ, определяли концентрацию белка и исследовали их в иммунофер-ментном анализе.
Конкурентный иммуноферментный анализ АТ к PAH
Аффинно очищенные АТ предварительно инкубировали с растворами каждого из конъ-югатов PAH-HK в течение 1 часа при 37 °C. Таким образом получали по 5 пробирок со смесью каждого АТ с каждым из исследуемых PAH. Конечное содержание АТ в ФСБ составляло 4 мкг/мл, содержание конъюгатов PAH-HK составляло 100 мкг/мл. В предварительных экспериментах было установлено, что в таком соотношении связывание АТ (например, АТ к Ac) с соответствующим иммобилизованным конъюгатом PAH-HK (Ac-HK) угнетается этим же конъюгатом в растворе (Ac-HK) более чем на 75%. Затем полученные смеси вносили в лунки полистироловых планшетов с иммобилизованными конъюгатами PAH-HK так, чтобы каждому АТ соответствовал свой PAH (смеси Ac-АТ вносили в лунки с иммобилизованным Ac-HK). После этого выявляли связавшиеся АТ по общепринятой схеме, используя АТ козы против Ig кролика, меченые пероксидазой хрена [4]. Контролем служили значения оптической плотности в
лунках с АТ без добавления конкурентов. Далее высчитывали показатели угнетения связывания АТ в присутствии каждого из конкурентов и выражали их в процентах.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Очищенные поликлональные АТ к РАН выделяли из сывороток кроликов после иммунизации их конъюгатами РАН-БСА на колонках PAH-HK-Sepharose 6В. В результате из 1 мл сыворотки удавалось получить по 0,14—1,2 мг АТ. С помощью неконкурентного иммуно-ферментного анализа установили, что полученные АТ не реагировали с БСА и с НК, но реагировали с конъюгатами РАН-НК. Иными словами, использованный нами подход позволяет просто, в один этап, избавиться от сопутствующих АТ к белку-носителю, получить и выявить искомые АТ к гаптену. В таблице представлены показатели угнетения связывания каждого из АТ с соответствующим иммобилизованным РАН после предварительной инкубации АТ с Ас, Ва, Вр, Сг, Р. Видно, что максимальное угнетение связывания (более 75%) достигается после инкубации каждого АТ с конъюгатом того РАН, который был использован для иммунизации и аффинного выделения АТ. Конкурирующее действие других РАН всегда было менее выраженным. Обратимся к горизонтальным строкам этой таблицы. Они показывают, как проявляет себя каждый РАН в отдельных парах АТ/соответ-
Таблица. Угнетение связывания РАН-АТ с соответствующими иммобилизованными конъюгатами РАН-НК после предварительной инкубации в растворе с конъюгатами РАН-НК (%)
Конкурирующие
Аффинно очищенные АТ к PAH
конъюгаты PAH-HK Ас-АТ Ba-АТ Bp-АТ Cr-АТ P-АТ
Ac-HK 86 19 35 14 7
Ba-HK 23 77 71 45 12
Bp-HK 16 55 87 54 17
Cr-HK 15 50 78 93 20
P-HK 19 50 72 33 76
Ac-HK Ba-HK Bp-HK Cr-HK P-HK
Иммобилизованные конъюгаты PAH-HK
Бензо(а)пирен
Бенз(а)антрацен
Пирен
Хризен
Антрацен
Рис. Внутренние иммунологические образы полициклических ароматических углеводородов
ствующий гаптен. Например, такой конкурент, как Ас-НК угнетает связывание в паре Ас-АТ/Ас-НК на 86%. Далее следуют показатели угнетения в парах Бр-АТ/Бр-НК (35%), Ва-АТ/Ва-НК (19%), Сг-Б/Сг-НК (14%), Р-АТ/Р-НК (7%).
Таким образом, сродство Ас со всеми полученными АТ уменьшается от большего к меньшему в следующей последовательности:
Ас: Ас > Бр > Ба > Сг > Р.
Аналогичные ряды для других гаптенов выглядят следующим образом:
Ба: Ба > Бр > Сг > Ас > Р
Сг: Сг > Бр > Ба > Р > Ас
Р: Р > Бр > Ба > Сг > Ас
Бр: Бр > Ба > Сг > Р > Ас
Как видно, сродство каждого из исследованных РАН по отношению к каждому из полученных АТ имеет свои характерные индивидуальные особенности. На первом месте по сродству к каждому из полученных АТ стоит соответствующий им РАН, использованный для иммунизации и аффинного выделения этого АТ, как и было сказано выше. На втором месте по сродству для Ас, Ба, Сг и Р стоит АТ к Бр. И это не удивительно. Каждое из этих соединений в той или иной мере является
структурной частью Бр, поэтому ни одно из них не встречает препятствий при вхождении в полость активного центра АТ к Бр. На третьем месте по сродству для Ас стоит АТ к Ба. И в этом случае действует такое же правило. Ас является структурной частью и Бр, и Ба, но полость активного центра АТ к Ба немного меньше, чем полость активного центра АТ к Бр. Поэтому связывание АТ к Ас с Ба немного слабее, чем с Бр. Во всех остальных случаях меньшее сродство гаптена по отношению к АТ иной специфичности обусловлено тонкими несоответствиями структуры или размера тем соединениям, которые были использованы для иммунизации и аффинной очистки. На рисунке представлены пять диаграмм с изображением внутренних иммунологических образов исследованных РАН. Каждая диаграмма содержит пять лучей, соответствующих доле угнетения связывания (в %) аф-финно очищенных АТ и соответствующим иммобилизованным конъюгатом РАН-белок в присутствии конкурента — исследуемого РАН.
Наибольшее иммунологическое сродство выявлено для Бр и Ба. Их диаграммы почти неотличимы, хотя Бр содержит 5 бензольных колец, а Ба — 4. Два других соединения из этой химической группы, а именно Сг и Р, также как и Ба состоят из 4 бензольных
колец, но резко отличаются от Ва и друг от друга по внутреннему иммунологическому образу. Еще более характерные особенности имеет внутренний иммунологический образ Ас, состоящий из 3 бензольных колец.
Таким образом, незначительные отличия в структуре химических соединений с низкой молекулярной массой являются причиной значительных отличий их внутренних иммунологических образов. Даже РАН с одинаковым количеством, но разным расположением бензольных колец (Ва, Сг, Р) имеют ярко выраженные особенности внутренних иммунологических образов. Разработанный нами подход позволяет изучать харак
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.