БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 4, с. 399-404
ш
ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ
УДК 577.112.7:612.017.4
МОДЕЛЬ ТРАНСЛОКАЦИИ СИБИРЕЯЗВЕННОГО ЭКЗОТОКСИНА
ВНУТРЬ КЛЕТКИ-МИШЕНИ
© 2014 г. А. Н. Носков#
ФГБУ "Научно-исследовательский институт им. Н.Ф. Гамалеи", 123098, г. Москва ул. Гамалеи, 18 Поступила в редакцию 24.10.2013 г. Принята к печати 05.02.2014 г.
На примере сибиреязвенного токсина предложен молекулярный механизм рецептор-опосредованного эндоцитоза для бинарных токсинов. В соответствии с этим механизмом внутрь клеток-мишеней из эндосомы проникают не отдельные эффекторные субъединицы, а олигомерный комплекс с общей структурой 7А + 7В. Для сибиреязвенного экзотоксина молекулярная масса такого комплекса составляет около 750 кДа.
Ключевые слова: бинарные токсины, сибиреязвенный экзотоксин, транслокация, рецептор-опосредованный эндоцитоз, олигомерный комплекс.
БО1: 10.7868/80132342314040095
Сибиреязвенный экзотоксин относится к группе бинарных пороформирующих токсинов с общей структурой А + В [1] и является основным фактором патогенности микроба Bacillus anthracis [2, 3]. Этот токсин состоит из 3 белков: протективного антигена (ПА) с М 83 кДа (ПА83), летального фактора (ЛФ, 90 кДа) и отечного фактора (ОФ, 89 кДа) [4-6]. Для цитотоксического воздействия на клетку-мишень необходимо проникновение в цитоплазму ЛФ и ОФ. ЛФ является Zn-зависимой эндопептида-зой, которая гидролизует внутриклеточные мишени — MAPK-киназы (mitogen-activated protein kinase kinases: MAPKKs, MKKs, MEKs) [7, 8]. ОФ относится к бактериальным аденилатциклазам и катализирует реакцию синтеза сAMP из ATP; избыток сAMP приводит к изменению водно-электролитного баланса клетки и активному выводу воды из клетки [6, 9]. В результате действия ЛФ и ОФ происходит разрушение клеток-мишеней, возникает отек тканей, что в конечном итоге приводит к токсическому шоку и гибели инфицированного хозяина [10, 11]. Основную роль в проникновении ЛФ и ОФ внутрь клеток-мишеней играют молекулы ПА, которые формируют оли-гомерный комплекс, взаимодействующий с рецепторами на поверхности клетки-мишени [12]. Для формирования олигомерного комплекса необходимы молекулы ПА с М 63 кДа (ПА63), которые образуются в результате гидролиза полипептидной цепи ПА83 по сайту R164KKRl молекулы
Сокращения: ПА — протективный антиген, ЛФ и ОФ — летальный и отечный факторы.
#Автор для связи (тел.: +7 (499) 190-57-42; факс: (499) 19057-42; эл. почта: a_n_noskov@mail.ru).
ПА83 клеточными и бактериальными протеина-зами с общей структурой узнаваемых ими аминокислотных последовательностей характерных для фурина (КФ 3.4.21.75) [13, 14].
Токсический комплекс формируется сложным путем с участием молекул ЛФ и ОФ. Согласно схеме, предложенной Кринтенсен с соавторами [15], сборка комплекса начинается с взаимодействия одной молекулы ПА63 с одной молекулой ЛФ. После этого к образовавшемуся димеру (ПА63—ЛФ) присоединяется еще одна молекула ПА63, образуя (ПА63)2—ЛФ. Комплекс из трех молекул достаточно устойчив, и потому происходит его взаимодействие с другим таким же комплексом с формированием олигомера, содержащего уже 4 молекулы ПА63. Образовавшийся тетрамер (ПА63)4—ЛФ2 взаимодействует с комплексом (ПА63)2—ЛФ, и образуется гексамер (ПА63)6—ЛФ3. На заключительной стадии сборки происходит встраивание в гексамер молекулы ПА63: (ПА63)6-ЛФ3 + ПА63 ^ (ПА63)7-ЛФ3. В результате образуется сложный комплекс, основанием которого является гептамер ПА63, имеющий пучок из гидрофобных петель с ионоселективным каналом внутри ("гидрофобная ножка" рецепторного комплекса), а сверху расположены 3 молекулы ЛФ, прочно связывающие по 2 молекулы ПА63 ножки. Имеются данные о том, что при значении рН 8.0 и выше может происходить встраивание в гекса-мер не молекулы ПА63, а комплекса (ПА63)2-ЛФ [16]. В этом случае может образовываться окта-мер, состоящий из 8 молекул ПА63 и 4 молекул ЛФ. Доля октамеров в токсическом комплексе составляет от 10 до 20%.
После сборки компонентов токсина в олиго-мерный комплекс происходит его взаимодействие со специфическими рецепторами — мем-брансвязанными белками TEM8 (tumor endothelium marker-8) и CMG2 (capillary morphogenesis protein-2) [17, 18]. В момент взаимодействия со специфическими рецепторами на клетки-мишени гидрофобная ножка гептамера из (ПА63)7 протыкает бислойную мембрану [19].
Кроме такой схемы предложен еще один вариант сборки токсина, включающий первичное присоединение ПА83 к рецепторам и сборку гептамера уже на поверхности клетки, с последующим присоединением эффекторных частиц — ОФ и ЛФ [19, 20]. Более того, предполагается, что сборка токсина может происходить как на поверхности клетки, так и в растворе вблизи ее поверхности, и именно этот момент, по мнению авторов, является регулирующим в определении скорости проникновения токсина в клетку.
Далее вступают в силу молекулярные механизмы, описанные в нашей предыдущей работе [21] и характерные для пороформирующих токсинов с общей структурой АВ5. В момент взаимодействия с токсином клетка-мишень находится в равновесном состоянии, определяемом стабильной функциональной активностью ферментативных и энергетических клеточных систем (концентрации ионов K+ и Na+, уровень активности основных ферментов клетки и др.). Любое изменение параметров этой системы (концентрации основных ионов, АТР, ADP и др.) тут же приводит к активации процессов, направленных на восстановление измененных параметров к исходному уровню. Поэтому после формирования в мембране катионселек-тивного канала основные ионы клетки K+ и Na+ начинают двигаться согласно своим концентрациям: Na+ внутрь клетки, K+ — из клетки. Изменение концентрации этих ионов внутри клетки приводит к активации K+/Na+-AТP-азы, которая восстанавливает исходные концентрации ионов, затрачивая на это дополнительные молекулы внутриклеточного АТР [22, 23]. Это в свою очередь изменяет существующее на момент формирования поры равновесие AТP/ADP в сторону снижения уровня AТP и увеличения ADP за счет гидролиза ATP активированными ATP-азами. Это инициирует синтез ATP из ADP с помощью креатинфосфокиназы посредством реакции с креатинфосфатом:
ADP + креатинфосфат = ATP + креатин.
Помимо креатинфосфатной системы, равновесие ATP/ADP внутри клетки поддерживается и с помощью митохондрий, которые задают достаточно высокий и стабильный уровень соотношения ATP/ADP, но не способны, в силу своей организационной структуры, быстро реагировать на
изменение АТP/АDP-равновесия. При быстром нарастании концентрации АDP, как это происходит в случае формирования поры пороформирующими токсинами (например, сибиреязвенным), именно посредством системы креатинфосфата восстанавливается уровень АТР Побочным продуктом этой реакции является креатин, являющийся слабой органической кислотой, что приводит к локальному повышению концентрации ионов Н+ внутри клетки рядом с образующийся порой. В результате индуцируется повышенная активность Н+-АТР-азы, поддерживающей определенный внутриклеточный уровень концентрации протонов, характеризуемый параметром рН. Появившийся избыток протонов выводится из клетки протонной АТР-азой, создавая при этом на внешней стороне мембраны избыток положительного заряда.
Этот избыток нейтрализует фосфатные группы фосфолипидных головок фосфатидилхолина (основного компонента плазматических мембран), и они теряют свою биполярность, становясь положительно заряженными за счет холиновой группировки. Как следствие, фосфатные группы начинают отталкиваться друг от друга, а не притягиваться друг к другу, как было ранее. В поверхностном слое мембраны нарастает напряжение, в результате чего головки фосфолипидов начинают активно занимать большее пространство, чем ранее.
В поверхностном слое мембраны рядом с протонной АТР-азой и сформированной токсином порой начинает расти электростатическое напряжение. Вектор этого напряжения направлен из клетки, и потому на первом этапе мембрана начинает выпячиваться, что можно было бы рассматривать как раннюю стадию экзоцитоза. Тем не менее, чаще всего процесс транслокации токсического комплекса в клетку завершается не экзоцитозом, а рецепторопосредованным эндоцитозом [19, 21, 24]. Это связано, прежде всего, с наличием нековалент-ных связей мембраносвязанных белковых цепей (АТР-азы, рецепторы, клатрины) с различными внутриклеточными структурами [25].
Эти связи обеспечивают клетке ее внешнюю архитектуру, за счет динамического взаимодействия этих структур с элементами цитоскелета [26—28] и они же удерживают участок мембраны с избыточным напряжением в поверхностном слое и тогда устранение избытка напряжения во внешнем слое мембраны достигается за счет эндоцитоза, т.е. погружения или втягивания мембраны внутрь клетки. Заряд, подобно капле, стекает внутрь клетки, и в какой-то момент мембрана в узком месте смыкается. Этому способствует давление со стороны ци-топлазматической жидкости, направленное на погружаемую в клетку часть мембраны.
Образуется эндосома, или шарик с внеклеточным содержимым, окруженный бислойной мембраной (рис. а). Погруженный в клетку замкнутый
МОДЕЛЬ ТРАНСЛОКАЦИИ СИБИРЕЯЗВЕННОГО ЭКЗОТОКСИНА
401
Рисунок. Основные этапы транслокации сибиреязвенного экзотоксина из эндосомы внутрь клетки-мишени (а—з): до-сборка токсического комплекса и блокирование ионселективного канала (а); увеличение размеров эндосомы и поры (б); протеинолиз сайта FFD315 в молекуле ПА63 (в); продвижение эффекторного комплекса 7ЛФ/ОФ + 7ПА16 градиентом протонов (г); возвращение ПА47 с остатками фрагментов петель внутрь эндосомы и удаление поры в мембране эндосомы (д); гидролиз ПА47 эндосомальными протеиназами (е); гидролиз внутриклеточной мишени ЛФ и синтез сАМР с помощью ОФ (ж); интеграция эндосомы в клеточную мембрану (з).
Н-АТРаза
Досборка токсического комплекса и блокирование ионоселективного канала
а
к+ """
K/Na-АТРаза
Увеличение размеров эндосомы и поры
Продвижение эффекторного комплекса градиентом H
Возращение в эндосому фрагментов ПА47 с остатками петель
ж
Гидролиз сайта FFD315 протеазами
Гидролиз ПА47 эндосомальными ферментами
Н-АТРаза
Интеграция в клеточную мембрану
Гидроли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.