БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 4, с. 646-655
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК: 577.112
МОДЕЛИРОВАНИЕ МУТАНТНЫХ ГОМО-И ГЕТЕРОДИМЕРОВ Р32Т ИНОЗИНТРИФОСФАТ ПИРОФОСФОГИДРОЛАЗЫ ЧЕЛОВЕКА ЫТРА
© 2015 г. Э.Б. Душанов, Х.Т. Холмуродов, Н.А. Колтовая
Объединенный институт ядерных исследований, 141980, Дубна Московской области, ул. Жолио-Кюри, 6
E-mail: koltovaya@jinr.ru
Поступила в p едакцию 17.12.14 г.
После доработки 17.04.15 г.
Для выявления конформационных изменений, обуславливающих инактивирующее действие мутации Р32Т, рассмотрена структура трех форм димера инозинтрифосфат пирофосфогидро-лазы человека hITPA. П роведен анализ наносекундной молекулярной динамики, вычислены значения среднеквадратичных отклонений атомов у гомодимеров дикого и мутантного типов, а также гетеродимера. В результате моделирования в течение 3 нс у мутантных протомеров наблюдали более сильные смещения атомов. В процессе моделирования наибольшим изменениям подверглись: петля между а2 и Р2 (аминокислотные остатки 28-33, область локализации мутации Р32Т), петля между Р5 и Рб и C-концевые аминокислотные остатки. Петля между а2 и Р2 имела две конформации, характеризующиеся разным положением боковой группы Phe31. Расстояние между Cys33(Ca) и Phe31(Cz) для протомеров дикого и мутантного типа составляло ~9,0 и 5,5 А соответственно. Эти конформации стабильно поддерживались.
Ключевые слова: МД-моделирование, инозинтрифосфат пирофосфатаза, мутантные гомо- и гетеродимерная Р32Т формы фермента.
В физиологических условиях нуклеотиды подвергаются химическим модификациям. Основной тип химических модификаций пуринов -это дезаминирование пуриновых оснований. Де-заминир ование аденина по C6 или гуанина по C2 приводит к образованию гипоксантина или ксантина соответственно. Гипоксантин в составе нуклеотида, т.е. гипоксантинрибозид, называется инозином. Неканонические нуклеотиды могут накапливаться в пуле нуклеотидов и включаться в ДНК и РНК, приводя к изменению генетической информации и структуры нуклеиновых кислот. Живые организмы имеют специфические ферменты (нуклеозидтрифосфат пирофосфогидролазы) для гидролиза таких неканонических нуклеозидтрифосфатов до нук-леозид монофосфатов и пирофосфата и таким обр азом выводят их из метаболических про -цессов.
Нуклеозидтрифосфат пирофосфогидролаза консервативна и у разных организмов имеет схожую структуру. Фермент человека инозинтрифосфат пирофосфатаза (hITPA - human Ino-
Cокpащения: hITPA (human Inosine Triphosphate Pyrop-hosphatAse) - инозинтрифосфат пирофосфатаза человека, МД - молекулярная динамика.
sine Triphosphate PyrophosphatAse) представляет собой гомодимер (аминокислотный остаток 194) объемом 68,00 х 75,29 х 110,79 А (рис. 1а). П ротомер состоит из центр альной платфор мы в-слоя и двух глобулярных кулачков (р ис. 1в): нижний кулачок - а1Р102Р2а3, верхний кулачок - а4а5в4в5аб. Каждый протомер имеет независимый активный центр с участком связывания иона Mg2+ и субстрата инозинтрифосфа-та, расположенный между кулачками. Комплекс фосфатазы формируется за счет водородных связей верхних кулачков каждого протомера. У человека достаточно широко распр остранена мутация hITPA-P32T, наличие которой может влиять на чувствительность пациентов к лекарственным препаратам [1]. Мутация располагается в нижнем кулачке. Механизм инактиви-рующего действия мутации неизвестен. Выдвинуто две гипотезы: согласно первой изменения затрагивают взаимодействие верхних кулачков протомеров и влияют на формирование димера [2], согласно второй - изменения в нижнем кулачке в мутантной петле приводят к оголению гидрофобного участка и протеосомозави-симой деградации полипептидной цепи [3]. Используя метод молекулярной динамики (МД), мы смоделировали конформацию трех форм
Рис. 1. Суперпозиция кристаллической (темный цвет) и равновесной (светлый цвет) структур гомодимера дикого типа 1ТТР-Р32 (а) и мутантного гомодимера 1ТТР-Р32Т (б) после моделирования в течение 3 нс. Отдельно изображен фрагмент, содержащий мутантную петлю. (в) - Приведены обозначения а-спиралей и Р-листов.
фермента (дикого типа, мутантного гомо- и гетеродимерного) и провели анализ структурных изменений, вызванных этой мутацией. В данной статье рассмотрено поведение трех белковых комплексов в процессе моделирования. В следующей статье будет проведен сравнительный анализ конечных структур моделиро-вания этих белковых комплексов между собой и с кристаллическими структурами дикого и мутантного типа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для МД-расчетов использовали модуль SANDER программного пакета AMBER [4] для специализированного компьютера MDGRAPE-2 [5]. Начальную геометрию комплекса для гомодимера дикого типа задали согласно кристаллической решетке, полученной с помощью рентгено структурного анализа (PDB соёе 2J4E) (ВгоокЬауеп Protein Data Bank Ьйр://^^^'.рёЬ.ог§). В молекуле выделили два протомера, левый и правый. Для получения начальной структуры мутантного гетеродимера в правом протомере осуществили замену P32T. П р и замене Р32Т в обоих протомерах получили начальную структуру мутантного гомодимера. Таким образом, моделирование осуществлялось с тремя независимыми комплексами: гомодимер дикого типа, мутантный гетеродимер и мутантный гомо-димер.
Компьютерное МД-моделирование включало в себя три последовательных этапа [6]. На первом этапе осуществляли молекулярно-меха-ническое вычисление минимума энергии кри-
сталлического состояния белка с окр ужающим водным раствором. Сольватацию системы про -водили при помощи модели TIP3P воды в заданном сферическом объеме [7]. Для расчета длин связей, включающих только атомы водорода, использовали стандартный метод SHAKE
[8]. Второй этап моделирования - нагревание системы с минимальным значением энергии от кристаллического состояния при T = 0 K до физиологических температур T = 300 K. При этом поиск структуры комплекса, которая отвечала бы минимуму энергии при T = 300 K, производили при очень медленном увеличении температуры, с шагом около 25 K. Третий этап - непосредственно сам процесс МД-вы-числения: после доведения системы до энергетически минимизированных состояний при T = 300 K (t = 0 нс) температуру системы поддерживали постоянной (300 K) в течение 3 миллионов шагов с помощью алгоритма Беренд-сена со вр еменем релаксации тер мостата 0,2 пс
[9]. Шаг интегрирования ньютоновских уравнений движения равнялся 1 фс, а общее время моделирования составило 3 нс.
Были вычислены все атомно-молекулярные взаимодействия и траектории всех атомов. При моделировании hITPA применили метод атом-но-силового поля Корнелла [10]. Энергетическое состояние системы, или общий потенциал взаимодействия, соответствовал равновесному положению системы, в котор ом силы притяжения уравновешивались силами отталкивания [6]. Учитывали различные типы взаимодействий, стабилизирующих структуру белка:
Значения среднего RMSDCa,Cz и RMSDCa моделированных вариантов hITPA
Форма Гомодимер дикого типа Мутантный гетеродимер Мутантный гомодимер
Значения среднего RMSDCa,Cz
D 1,63 ± 0,26 (0,70-2,14)* 1,75 ± 0,26 (0,61-2,09) 1,65 ± 0,36 (0,55-2,33)
L 1,65 ± 0,27 (0,69-2,23) 1,70 ± 0,21 (0,69-2,19) 1,53 ± 0,38 (0,55-2,44)
R 1,62 ± 0,27 (0,72-2,10) 1,78 ± 0,37 (0,53-2,33) 1,75 ± 0,37 (0,55-2,36)
Значения среднего RMSDCa
D 1,70 ± 0,26 (0,72-2,21) 1,82 ± 0,26 (0,65-2,18) 1,88 ± 0,38 (0,58-2,47)
L 1,70 ± 0,27 (0,69-2,33) 1,74 ± 0,21 (0,76-2,21) 1,65 ± 0,37 (0,59-2,47)
R 1,69 ± 0,28 (0,76-2,17) 1,87 ± 0,37 (0,54-2,38) 2,07 ± 0,42 (0,58-2,63)
D-** 1,53 ± 0,26 (0,67-2,02) 1,57 ±0,25 (0,55-1,93) 1,52 ± 0,34 (0,54-2,18)
L- 1,61 ± 0,29 (0,64-2,24) 1,52 ± 0,20 (0,60-2,02) 1,46 ± 0,36 (0,52-2,37)
R- 1,45 ± 0,24 (0,70-1,90) 1,60 ± 0,37 (0,49-2,17) 1,57 ± 0,35 (0,55-2,19)
Примечания. Б - димер, Ь - левый протомер, К - правый протомер. *В скобках приведены максимальные и минимальные значения ЯИЗБ. **Знак «-» указывает, что при вычислении КИЗОСа были исключены аминокислотные остатки 1-5, 27-34, и 124-129 и 182-185.
U(r) = ^Кг(т - %)2 + £К9(е - 0eq)2 + + YjK „(1 + cos[«9 - у])/2 +
+ TV rf - в/r6) + Ъя/ ,
где LKr(r - req)2 - потенциал внутримолекулярных (валентных) связей; LKe(0 - 0eq)2 - потенциал угловых связей (вр ащений); 'к„(1 + cos[n„ - у])/2 - потенциал дигедральных (торсионных) вращений; L(A-Jr-}2 - B-Jr-6) - потен-
ч ч ч ч циал невалентных (ван-дер-ваальсовых) взаимодействий; 'Lq-qj/er-j - электро статический потенциал.
Результаты моделирования и трехмерные изображения белкового комплекса hITPA анализировали с помощью программных пакетов RasMol [11] и MOLMOL [12], а также пакета Visual Modular Dynamks (VMD) [13].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для моделирования структуры мутантных форм белка (гомо- и гетеродимера) использовали кр исталлическую структуру полного фермента с разрешением 2,8 А (РБВ ассе88юп соёе 214Е) [2]. В состав белка помимо двух протомер ов входили кофактор М§2+ (два иона) и субстрат инозинтрифосфат (две молекулы). В живой клетке на третичную структуру белка огромное влияние оказывают взаимодействие полипептидной цепи с растворителем (водой) и температура. После сольватации проводили нагревание до 300 К и динамическое модели-
рование в течение 3 нс. На рис. 1 приведены наложения на исходную кристаллическую структуру димера дикого типа двух моделиро -ванных равновесных (3 нс) гомодимерных форм дикого типа (рис. 1а) и мутантного типа (рис. 1б). Видно, что в целом структур ы совпадают.
Для характер истики основной полипептидной цепи мы рассмотрели атомы Са, С, N. Отметим, что лежат они в одной плоскости и вращение вокруг пептидной связи С О-К Н обычно сильно заторможено. При рассмотрении основной полипептидной цепи динамические модели фермента приняли равновесное со -стояние спустя ~0,6 нс [14]. П ри этом к концу моделирования наибольшие смещения RMSDCa'C'N наблюдались у гетеродимера и меньшие - у мутантного гомодимер а. Элементы вторичной структуры образуют довольно жесткий каркас, валентные колебания которого хар актеризуются вр еменами 10-13 с и амплитудами смещения атомов до ~0,1 А [15]. Каркас окружен значительно более подвижными боковыми группами с характерными
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.