МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2010, том 44, № 6, с. 1054-1063
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ
УДК: 571.27:577.322:578.23
МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННЫХ СТРУКТУР КОМПЛЕКСОВ TNF-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ CrmB ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ
И ВИРУСА ОСПЫ КОРОВ С TNF МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА © 2010 г. Т. С. Непомнящих*, Д. В. Антонец, Л. Р. Лебедев, И. П. Гилева, С. Н. Щелкунов
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"Роспотребнадзора, Кольцово,
Новосибирская обл., 630559 Поступила в редакцию 16.03.2010 г. Принята к печати 26.03.2010 г.
Геномы ортопоксвирусов кодируют ряд гомологичных секретируемых белков, связывающих фактор некроза опухолей (TNF). Репертуары этих белков у различных видов ортопоксвирусов отличаются. Вирус натуральной оспы кодирует лишь один из них, названный CrmB. Несмотря на высокую межвидовую гомологию белков CrmB, их физико-химические и биологические свойства имеют ряд видоспецифических особенностей. Нами построены модели комплексов TNF-связывающих доменов белков CrmB вируса натуральной оспы и оспы коров с TNF мыши и человека. Аналогичные модели созданы и для мутантной формы TNF человека. В последнем случае остаток Arg31, принимающий участие в связывании с рецепторами, заменен на Gln, характерный для TNF мыши. Анализ структур лиганд-рецепторных комплексов показал, что наименьшей стабильностью из построенных комплексов обладает комплекс белка CrmB вируса оспы коров с TNF человека, а замена Arg31Gln в значительной степени стабилизирует взаимодействие белка CrmB вируса оспы коров с мутантной формой TNF человека. Результаты экспериментов по сравнительному изучению способности рекомбинант-ных белков CrmB вируса натуральной оспы и оспы коров ингибировать цитопатическое действие указанных TNF подтвердили предсказания, сделанные на основе моделирования.
Ключевые слова: TNF, TNF-связывающий белок CrmB, молекулярное моделирование, вирус натуральной оспы, вирус оспы коров.
MODELING SPATIAL STRUCTURES OF VARIOLA AND COWPOX VIRUS TNF-BINDING CrmB PROTEINS BOUND TO MURINE OR HUMAN TNF, by T. S. Nepomnyashchikh*, D. V. Antonets, L. R. Lebedev, I. P. Gileva, S. N. Shchelkunov (State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Novosibirsk region, 630559 Russia, *e-mail: antonec@ngs.ru). Orthopoxviruses bear in their genomes several genes coding for homologous secreted proteins able to bind tumor necrosis factor. Different species of the genus possess different sets of these tumor necrosis factor-binding proteins. Viriola virus encodes the only one of them named CrmB. Despite sharing high sequence identity, CrmB proteins belonging to distinct orthopoxviral species were shown to significantly differ by their physico-chemical and biological properties. We modeled spatial structures of tumor necrosis factor receptor domains of variola and cowpox virus CrmB proteins bound to either murine, or human or mutated human tumor necrosis factor . In the sequence of last the arginine residue at position 31 is substituted with glutamine that is characteristic for murine tumor necrosis factor. Theoretical analysis of modeled ligand-receptor complexes revealed that the least stable should be the complex of cowpox virus CrmB with human tumor necrosis factor, and that arginine to glutamine substitution at position 31 should significantly stabilize binding of corresponding human tumor necrosis factor mutant to cowpoxvirus CrmB. Experimental evaluation of recombinant variola and cowpox virus CrmB efficiencies in inhibiting cytotoxic effect of all these tumor necrosis factors have approved our predictions.
Keywords: TNF, TNF-binding protein CrmB, molecular modeling, variola virus, cowpox virus.
Принятые сокращения: CPXV — вирус оспы коров; CRD — цистеин-богатый домен; Crm — модификатор цитокинового ответа; h(TNF, TNFR) — (TNF, TNFR) человека; LT — лимфотоксин; mh — мутантный человека; mu — мышиный; TNF — фактор некроза опухолей; TNFR I и TNFR II — клеточные рецепторы TNF первого и второго типа; VACV — вирус осповакцины; VARV — вирус натуральной оспы; ОП — оптическая плотность.
* Эл. почта: antonec@ngs.ru
ВВЕДЕНИЕ
Входящие в семейства TNF-лигандов и рецепторов белки — ключевые регуляторы онтогенеза, пролиферации, жизнеспособности и дифференциров-ки клеток и координаторы как врожденных, так и антигенспецифических защитных реакций иммунной системы организма [1, 2]. В настоящее время известно более 40 представителей семейства рецепторов TNF [2]. В основном это трансмембранные белки типа I, экстраклеточный фрагмент которых взаимодействует с лигандами, принадлежащими к семейству TNF, а внутриклеточный домен обеспечивает передачу сигнала, взаимодействуя с соответствующими адаптерными белками [1, 2]. Несмотря на относительно низкую идентичность аминокислотных последовательностей белков, относящихся к семейству TNF-рецепторов (20—34%) [3], их TNF-связывающие домены обладают сходной пространственной структурой. Характерная структурная особенность представителей этого семейства — наличие от 1 до 6 цистеин-богатых доменов (CRD — Cysteine Rich Domain — псевдоповтор длиной около 40 аминокислотных остатков). Наиболее часто у TNF-ре-цепторных (TNFR) белков присутствуют три-четыре таких домена (как у TNFR I и TNFR II). Границы цистеин-богатых доменов определены внутримолекулярными дисульфидными связями между консервативными цистеиновыми остатками [2]. Комплексы TNF-рецепторных белков с их лигандами — гете-рогексамеры, в которых с гомотримерной молекулой лиганда связано три молекулы рецептора. Каждая молекула рецептора контактирует с двумя мономерами лиганда, располагаясь в "борозде" между ними, и не взаимодействует с другими молекулами рецептора в составе комплекса. Аминокислотные остатки рецептора, принимающие участие в связывании лиганда, преимущественно расположены в петле 50, локализованной в CRD2, и в петле 90, расположенной в CRD3 [1, 4].
В настоящее время описаны гомологи клеточных TNF-рецепторов, кодируемые ортопоксвирусами. Это растворимые TNF-связывающие белки (CrmB, CrmC, CrmD и CrmE), в большом количестве секре-тируемые инфицированными клетками [5—8]. Различные ортопоксвирусы имеют разные наборы TNF-связывающих белков [9]. Наибольшее количество TNF-связывающих белков обнаружено у вируса оспы коров (CPXV). У вируса натуральной оспы (VARV) из этого семейства белков присутствует только CrmB. Показано, что поксвирусные TNF-связывающие белки являются важными факторами вирулентности, поскольку вирусы, лишенные кодирующих их генов, в значительной степени аттенуи-рованы [10, 11].
Установлено, что повышенный уровень экспрессии TNF — один из ключевых факторов, обуславливающих развитие ряда тяжелых хронических воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний чело-
века, таких как ревматоидный артрит, болезнь Крона, псориаз и псориатический артрит и других, и анти-ТЫР-терапию успешно используют для лечения пациентов, страдающих такими заболеваниями [12—15]. Изучение молекулярных механизмов взаимодействия ортопоксвирусных TNF-связывающих белков с их клеточными лигандами чрезвычайно важно для понимания их биологической активности и может быть полезно для разработки на основе этих вирусных белков новых лекарственных препаратов для анти-ТЫР-терапии. Основной источник информации о взаимодействии рецепторов с лигандами — пространственные структуры их комплексов. Поскольку структуры белков CrmB и их комплексов с TNF в настоящее время не известны, одним из решений может быть создание моделей пространственных структур комплексов CrmB + TNF на основе структур других TNF-рецепторных белков и их комплексов с лигандами, полученных с помощью рентгеноструктурного анализа [16—18].
В данной работе описаны результаты теоретических предсказаний эффективности связывания TNF мыши (mu) и человека (h), а также ряда му-тантных форм hTNF (mhTNF) с белками VARV-CrmB и CPXV-CrmB, сделанных на основе анализа моделей четвертичных структур лиганд-рецептор-ных комплексов этих белков. Представлены результаты сравнительного изучения способности этих TNF-связывающих белков ингибировать ци-топатическое действие различных TNF в системе in vitro, доказавшие правильность сделанных предсказаний.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы. 96-луночные планшеты фирмы "Orange Scientific" (США), среду Грейса, антибиотики и L-глютамин фирмы "Gibco/BRL" (США), среду DMEM производства ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" (Кольцово, Россия) и эмбриональную сыворотку коров производства ООО "БИОЛОТ" (Санкт-Петербург, Россия) использовали для культуральных работ. Рекомбинантный hTNF (6 х 107 ед/мг) любезно предоставлен Ю.Н. Козловой (ИХБФМ СО РАН, Новосибирск). Препараты muTNF (3 х х 107 ед/мг) [19] и мутеинов mhTNF(R31Q) (2 х х 107 ед/мг) [20] и mhTNF(E127Q) (7 х 106 ед/мг) выделены из соответствующих штаммов-продуцентов по методу, описанному в работе [21]. Рекомби-нантная плазмидная ДНК, кодирующая мутеин mhTNF(E127Q), любезно предоставлена Л.Н. Шин-гаровой (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва). Белки VARV-CrmB и CPXV-CrmB получены нами ранее [19].
Культура клеток. Использована линия клеток мышиных фибробластов L929 из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". Клетки линии L929 культивировали в атмосфере 5% CO2 при 37°C
в среде DMEM 2 мМ L-глютамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
Определение биологической активности белков CrmB in vitro. Активность белков CrmB определяли по их способности ингибировать цитотоксическое действие TNF на культуре клеток фибробластов мыши L929, как описано в работе [19]. Результаты выражали в процентном отношении выживших клеток относительно количества клеток в необработанных цитокинами контрольных пробах. Каждую точку повторяли три раза и среднее значение процента выживаемости высчитывали по формуле:
(OnTNF + CrmB OnTNF)/(On„ - OHtnf) x 100%.
Измерение оптической плотности проводили на приборе Microplate Reader ELX808 ("BIO-TEK INSTRUMENTS, INC.", США) при длине волны 550 нм.
Моделирование структуры TNF-рецепторных доменов белков CrmB VARV и CPXV и их ко
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.