МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 5, с. 708-715
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.8.017.73:577.152
МОДИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ЕСТЕСТВЕННЫМИ ХИМИЧЕСКИМИ ШАПЕРОНАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ
© 2004 г. Е. И. Мартиросова*, Т. А. Карпекина**, Г. И. Эль-Регистан**
*Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва **Институт микробиологии РАН, Москва Поступила в редакцию 16.02.04 г.
Впервые продемонстрирована способность алкилоксибензолов - ауторегуляторных факторов d1 микроорганизмов, участвующих в стрессовом ответе клетки, стабилизировать ферменты в водных средах, сопряженное с повышением их каталитической активности. Стабилизирующее действие одного из химических аналогов алкилоксибензолов - С7-АОБ было показано в опытах in vitro с ферментами микробного происхождения - протеазой (продуцент Bacillus licheniformis), целлюлазой (продуцент Trichoderma viride) и а-амилазой (продуцент Bacillus subtilis) и выражалось в существенном расширении температурного и рН-диапазонов катализа. Модуляция каталитической активности стабилизированных ферментов зависели от концентраций С7-АОБ и продолжительности предынкубации образующихся комплексов. Показано существенное влияние на эффективность катализируемых гидролазами реакций модификации структуры не только ферментов, но и полимерных субстратов в результате их комплексообразования с С7-АОБ. Получены сравнительные характеристики эффективности гидролитических реакций в вариантах модификации с помощью С7-АОБ структуры как ферментов, так и субстратов.
Ключевые слова: стабильность ферментов, структурная модификация биополимеров, химические шапероны, алкилоксибензолы, стресс.
Ранее было показано, что ауторегуляторные факторы ^ - контролирующие развитие микробных культур, накапливаясь в среде роста до порогового уровня, вызывают переход культуры к стационарной фазе развития, а при дальнейшем возрастании концентраций - к развитию в вегетативных клетках анабиотического состояния [1]. По химической природе факторы ^ некоторых микроорганизмов относятся к алкилоксибензо-лам (АОБ) и присутствуют в развивающихся культурах в виде смеси изомеров и гомологов [2, 3]. Химические свойства этих ауторегуляторов определяют их способность к нековалентным взаимодействиям с биологическими молекулами и надмолекулярными структурами (мембранами) за счет образования межмолекулярных водородных связей, ионных и гидрофобных взаимодействий, что может быть зафиксировано в изменении функциональной активности макромолекул ферментов [4-6], и биологических мембран [7], а на уровне клеток - в повышении их устойчивости к повреждающим воздействиям, высоким температурам, окислительному стрессу и др. [8].
В работах по изучению механизмов развития анабиотического состояния в покоящихся формах микроорганизмов, где в качестве химического аналога факторов бактерий использовали гексилрезорцин (спиртовой раствор), была показана его способность стабилизировать структуру
макромолекул ферментов в образующихся комплексах белок-АОБ, обеспечивая приобретение ферментами сопряженных свойств пониженной метаболической активности и высокой устойчивости к денатурирующим воздействиям (фотоокислению, температуре, рН). Полученные данные позволили заключить, что алкилоксибензолы (активное начало факторов dx) обладают функциями химических шаперонов и могут играть роль естественных структурных модификаторов ферментов, принимая участие в блокировании метаболизма в гипометаболических и анабиотических клетках путем образования каталитически низко активных и термостабильных комплексов с ферментами [4, 9]. Аналогичные функции были показаны для длинноцепочечных 5я-алкилрезор-цинов, широко присутствующих в растениях и бактериях [5, 6, 10].
Однако при верификации гипотез микробного анабиоза было сделано предположение, что в покоящихся формах некоторые ферменты, в частности гидролазы, могут иметь конформацию, обеспечивающую их высокую стабильность, сопряженно с высокой каталитической активностью, что обуславливает интенсивный гидролиз споровых структур на стадии инициации прорастания покоящихся форм, когда синтез ферментов de novo отсутствует. Этому предположению не противоречит теория химической энзимологии,
согласно которой стабилизация молекулярной структуры ферментов может сопровождаться как ингибированием, так и стимуляцией их каталитической активности [11].
Целью данной работы было изучение влияния на активность и стабильность микробных проте-аз, целлюлаз и а-амилазы в опытах in vitro химического аналога факторов d1, относящегося к ал-килрезорцинам, отличающегося от гексилрезор-цина меньшей гидрофобностью молекулы.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве моделей для изучения модификации структуры ферментов алкилоксибензолами были использованы препараты ферментов микробного происхождения. Нейтральнощелочная протеаза, продуцент Bacillus licheniformis (производство "Ende Industrial Co", США, активность 440000 DAPU/g, оптимальные значения рН 7.08.0 и Топт = 60°C), целлюлаза, продуцент Trichoder-ma viride (производство "Восток", активность 2000 ед/г, оптимальные значения рН 4.0 и Топт = = 50°C) и концентрированный препарат а-амила-зы, продуцент Bacillus subtilis (производство "Восток", активность 2000 ед/мл, оптимальные значения рН 6.0 и Топт = 60°C). В качестве структурного модификатора ферментов использовали химический аналог факторов d1 бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter - С7-АОБ, один из ко-роткоцепочечных алкилрезорцинов, амфифиль-ное соединение с рКа = 9, степень чистоты 99.9%.
Определение протеолитической активности (модифицированный метод Ансона). Для проведения гидролиза готовили: 2%-ный раствор субстрата (казеин по Гамерстену) и раствор фермента с активностью 22 ед/мл в 0.06 М фосфатном буфере, рН 7.2. Раствор С7-АОБ (350 мг/50 мл воды) разводили до необходимых концентраций. В реакционную смесь вносили по 2 мл фермента и субстрата и 1 мл С7-АОБ (все компоненты предварительно термостатировали при 40°C в течение 10 мин) - в случае беспредикубационного варианта. В вариантах с предынкубацией комплексов АОБ-фермент или АОБ-субстрат - к 2 мл или фермента, или субстрата добавляли 1 мл С7-АОБ, смесь выдерживали 40 мин при комнатной температуре, затем термостатировали 10 мин при 40°C и использовали в реакции. В вариантах с предынкубацией и фермента, и субстрата - к 4 мл фермента и к 4 мл субстрата добавляли по 1 мл С7-АОБ, и после соответствующих процедур отбирали по 2.5 мл смеси фермент-С7-АОБ и субст-рат-С7-АОБ для реакции гидролиза. В контрольные варианты вместо С7-АОБ вносили такое же количество воды; в контрольных вариантах фермент предынкубировали такое же время, как и в опытных. Гидролиз проводили при Т = 40°C в течение 20 мин. Реакцию останавливали добавлени-
ем 4 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Концентрацию низкомолекулярных белковых соединений, неосаждаемых 5%-ной ТХУ, определяли по изменению экстинкции (к = 280 нм) су-пернатантов, полученных после фильтрования (не менее двух раз) реакционной смеси. Поскольку при к = 280 нм С7-АОБ имеет собственное све-топоглощение, то для каждой концентрации С7-АОБ измеряли его контрольный уровень, при вычете которого, определяли истинную концентрацию низкомолекулярных белковых соединений.
Определение целлюлолитической активности (метод определения редуцирующих веществ с 3,5-динитросалициловым реагентом). Для проведения гидролиза готовили: 0.75%-ный раствор субстрата (натриевая соль карбоксиметилцеллюло-зы) и раствор фермента с активностью 3 ед/мл в 0.12 М цитратно-фосфатном буфере, рН 4.5; раствор С7-АОб (350 мг/50 мл воды). В реакционную смесь вносили по 2 мл фермента и субстрата и 1 мл С7-АОБ необходимой концентрации - в случае беспредынкубационного варианта. Последовательность процедур в предынкубационных вариантах аналогична описанным для протеолитической активности. В контрольные варианты вместо раствора С7-АОБ вносили 1 мл воды. Гидролиз проводили при 50°C в течение 2 ч. После окончания гидролиза растворы охлаждали до комнатной температуры и сразу отбирали из них аликвоту для определения содержания в пробах редуцирующих веществ (РВ) с 3,5-динитросали-циловым реагентом.
Определение амилолитической активности (метод определения редуцирующих веществ с 3,5-динитросалициловым реагентом). Для проведения гидролиза готовили: 1%-ный раствор субстрата (крахмала) и раствор фермента с активностью 0.1 ед/мл в фосфатном буфере, рН 6.0; раствор С7-АОБ (420 мг/50 мл воды). В реакционную смесь вносили 2 мл субстрата, 0.5 мл фермента и 0.5 мл раствора С7-АОБ необходимой концентрации - в случае беспредынкубационного варианта (предынкубационные варианты аналогичны описанным для протеолитической активности). В контрольные варианты вместо раствора С7-АОБ вносили 0.5 мл воды. Гидролиз проводили при 30°C в течение 10 мин. Реакцию останавливали добавлением 3 мл 1.0 N HCl. Концентрацию РВ в гидролизате определяли по цветной реакции с 3,5-динитросалициловым реагентом.
Поскольку в присутствии С7-АОБ 3,5-динит-росалициловый реагент образует с крахмалом окрашенное соединение, то для каждой концентрации С7-АОБ измеряли его фоновый уровень, при вычете которого определяли истинную концентрацию РВ в гидролизате.
Исследование действия С7-АОБ на температурный диапазон катализа определяли, применяя
% активность от контроля 400
350 300 250 200 150 100' 50 0
160 140 120 100+ 80
(в)
0 1.61 3.22 4.83 6.44 8.05 9.66 11.27 Концентрация С7-АОБ, мМ
Рис. 1. Действие С7-АОБ на протеолитическую (а), целлюлолитическую (б) и амилолитическую (в) активности при различных способах его внесения: предынкубации с раствором фермента (1) и беспре-дынкубационном (2).
беспредынкубационный способ образования комплексов АОБ-фермент; гидролиз проводили в диапазоне температур 20-90°C - в случае проте-аз; и 5-90°C - в случае целлюлаз.
Изменение рН-диапазона катализа целлюлаз в присутствии С7-АОБ определяли в экспериментах с различными значениями рН от 2.5 до 8.0.
Повторность измерений в экспериментах пятикратная при постановке 3 независимых серий опытов. Представленные результаты отражают усредненные величины; с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.