МОДИФИЦИРОВАННЫЙ БИОФЛАВОНОИД ПОДАВЛЯЕТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ МОНОНУКЛЕАРОВ
Албегова Д.З.1, Павлова С.И.2/3, Дибирова Г.О.1/2, Дмитриева Н.Б.1/2, Козлов И.Г.1/2
'ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова Минздрава России, Москва, 2ФГУ ФНКЦДетской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева, Москва, 3ФГБОУ ВПО Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова, Чебоксары,Россия
В результате развития новых областей медицины сформировалась унифицированная идеология, так называемой, прицельной или мишень-направленной терапии. В связи с этим поиск новых таргетных лекарственных средств, способных селективно корригировать ключевые звенья патогенеза того или иного заболевания приобретает все большую актуальность. Одним из перспективных направлений в этой области является разработка менее токсичных и более специфичных иммуносупрессивных лекарственных средств. Пристальное внимание исследователей в последнее время уделяется изучению флавонои-дов - большой группы полифенольных соединений, присутствующих практически во всех высших растениях. Целью нашего исследования являлось изучение влияния модифицированного биофлавоноида на пролиферацию человеческих мононуклеаров (МНК), активированных Т- и В-клеточными митогенами и сравнение этого эффекта с кверцетина дигидратом. В результате эксперимента было установлено, что применение обоих агентов в различной степени дозозависимо подавляло пролиферацию ФГА-, анти-СБ3- и Р'ШМ-активированных МНК. Так, было показано, что модифицмрованный биофлавоноид в отличие от кверцетина дигидрата, активнее подавляет пролиферацию МНК, а, следовательно, является более интересным для дальнейшего изучения.
Ключевые слова: флавоноиды, мононуклеарные клетки, пролиферация
В связи с завершением интенсивных исследований в биотехнологии и иммунологии, а также молекулярной биологии и генетике рака, во второй половине XX века были разработаны и внедрены принципиально новые иммуносупрессанты и противоопухолевые препараты. Примерами таковых лекарственных средств являются моноклональных антитела и низкомолекулярные ингибиторы сигнальных молекул (циклоспорин, макролидные антибиотики, «тинибы») [1]. Механизмы действия таких лекарственных средств основаны не на неспецифическом уничтожении активно пролиферирующих клеток, а целенаправленной элиминации/угнетении опухолевых или иммунокомпетентных клеток идентичной природы. Перспективы развития данных областей фармакотерапии тесно связаны с открытием более специфичных мишеней. Так,
несомненно, актуальным является изыскание высоко избирательных иммуносупрессантов, не оказывающих влияния на клетки, которые не участвуют в иммунном ответе в момент терапевтического использования препаратов. Мишенью для этой подгруппы может являться запущенный в активированных лимфоцитах конкретный регуляторный или эффекторный механизм [2]. Идеальный им-муносупрессант должен обладать избирательным действием на отдельные субпопуляции лимфоцитов, не вызывая повреждения как других клеток организма, так и клонов лимфоцитов, осуществляющих реакции противоин-фекционного и противоопухолевого иммунитета. На место подобных иммуносупрессантов на сегодняшний день претендуют так называемые «регуляторы/переключатели» иммунного ответа. С точки зрения разработки новых
лекарственных препаратов, большой интерес представляет класс полифенольных соединений растительного происхождения. Изучение их механизмов действия на клеточном и молекулярном уровнях показывает, что некоторые флавоноиды способны селективно влиять на активность протеинкиназ, а как следствие и на активацию сигнальных путей в клетках млекопитающих [3, 4, 5].
Необходимо подчеркнуть, что во многих экспериментальных исследованиях показано, что иммунотропная активность большинства флавоноидов, обусловлена блокадой ферментов сигнальных путей и факторов транскрипции, вовлеченных в процессы активации, пролиферации и реализации эффекторных функций клеток иммунной системы. В ряде случаев авторами приводятся данные об эффективности флавоноидов в экспериментальной терапии модельной иммунопатологии, свидетельствуя о перспективности их как основы для создания новых фармакологических агентов, подавляющих или «регулирующих» иммунный ответ.
Целью нашего исследования являлось изучение влияния модифицированного био-флавоноида (МБФ) на пролиферацию человеческих мононуклеаров, активированных Ти В-клеточными митогенами и сравнение этого эффекта с кверцетина дигидратом (КД).
Перед началом исследований были проведены предварительные эксперименты, целью которых являлся подбор агентов (митогенов), индуцирующих пролиферацию лимфоцитов периферической крови человека, а также установление оптимальных концентраций этих веществ. Лимфоциты периферической крови человека активировали фитогемагглютинином (ФГА), анти-СБ3 моноклональными антителами (анти-СБ3) и поквид-митогеном (PWM). Митогены были протестированы в условиях in vitro в диапазоне концентраций 1,0-30,0 мкг/мл. Уровни оптимальных концентраций активирующих агентов приведены в табл.
Табл. Действующие концентрации агентов, активирующих лимфоциты
Для оценки влияния исследуемого препарата на клеточную пролиферацию использовался метод оценки репликации ДНК, основанный на включении радиоактивной метки (3Н-тимидин) в ДНК делящейся клеток. Для этого клеточную суспензию засевали в 96-лу-ночный круглодонный (для клеток с суспензионным ростом) планшет в конечной концентрации 0,2х106 клеток/лунка в полной питательной среде. Клетки инкубировали при 37 °С, 100% влажности и 5% содержании углекислого газа в окружающем воздухе.
Через 24 ч преинкубации МНК с оптимальными концентрациями митогенов в опытные лунки вносили МБФ или КД и продолжали инкубацию еще в течение 48 ч. Во всех случаях исследуемый агенты (МБФ и КД) тестировали в диапазоне концентраций 10-9-10-7 моль/мл (по 4 лунки на каждую концентрацию). В контрольные лунки вносили соответствующие объемы растворителя. За 16 часов до окончания культивирования в лунки добавляли радиоактивную метку (3Н-тимидин, конечная концентрация в лунке 5 мкКю/мл).
По истечении времени инкубации клетки из лунок собирали на автоматическом сборщике клеток, перенося радиоактивный материал на стеклянноволокнистые фильтры типа НА-930 (Whatmann, Великобритания). Затем высушенные фильтры помещали во флаконы из кварцевого стекла, содержащие по 4 мл сцинтилляционного раствора. Радиоактивность подсчитывали на счетчике (3-частиц. При оценке действия экспериментального препарата сравнивали значения включений 3Н-тимидина в лунках с добавлением исследуемых агентов, и в контроле. Среднее значение для четырех измерений радиоактивности при каждой исследуемой концентрации выражали в процентах от контроля по следующей формуле:
(имп/мин) в опыте х100% (имп/мин) в контроле
Было выявлено, что внесение как МБФ так и КД в опытные лунки дозозависимо подавляло пролиферацию ФГА -, анти-СБ3- и PWM -активированных МНК (рис.).
На рис. видно, что антипролиферативная активность обоих агентов была выше по отношению к мононуклеарам, активированным ФГА, анти-СБ3 и PWM, однако значительно и достоверно (р<0,05) отличалась в зависимости от используемого препарата. Эффект
Активирующий агент, мкг/мл
для В-лимфоцитов для Т-лимфоцитов
PWM ФГА Анти-СБ3
5,0 10,0 5,0
Рис. Влияние МБФ/КД на пролиферацию митоген-активированных мононуклеаров периферической крови человека in vitro. Митогены: анти-СБЭ-моноклональные антитела (анти-СБЭ), фитогемагглютинин (ФГА), поквид-митоген (PWM). Уровень пролиферации клеток, не инкубированных с МБФ/КД (контроль), соответствует 100%.
МБФ в концентрации 10-9 моль/мл составил 98,3±4,5%, 94,5±5,7% и 101,2±5,8% соответственно для МНК, стимулированных ФГА, анти-СБЭ и PWM. Для препарата КД процент пролиферации составил 102,3±4,9%, 98,1±6,4% и 100,5±7,1% для клеток, стимулированных ФГА, анти-СБЭ и PWM соответственно. Данные значения обоих препаратов не имели достоверных различий в сравнении с контрольными значениями. Увеличение концентрации МБФ до 5*10-9 моль/мл, привело к некоторому снижению процента пролиферации: 7Э,5±6,5%, 68,6±4,7% и 78,3±6,8% для МНК, стимулированных ФГА, анти-СБЭ и PWM. Для КД в той же концентрации, значения были немного выше: 88,5±5,9%, 84,Э±5,4% и 91,7±6,1% для клеток, стимулированных ФГА, анти-СБЭ и PWM. В концентрации 10-8 моль/мл разница в проценте пролиферации между двумя агентами МБФ и КД была также статистически достоверной (p<0,05). Так, пролиферация при использовании веществ в отношении МНК, стимулированных ФГА и анти-СБЭ составила Э6,5±4,5% и Э1,7±6,7% для МБФ, в сою очередь для КД - 52,5±4,9% и 48,4±5,7% соответственно, в отношении клеток, активированных PWM 41,6±4,8% (МБФ) и 60,8±5,1% (КД). При внесении в лунки МБФ в концентрации 5*10-8 моль/мл процент пролиферации составил 5,2±2,5% и Э,5±1,5% соответственно,
при стимуляции ФГА и анти-СБЭ, и 7,4±Э,5% при активации PWM. При использовании КД значения пролиферации составили 26,Э±5,2%, 21,7±Э,8% и Э0,5±6,Э% при стимуляции тремя митогенами соответственно. Процент пролиферации МНК, стимулированных ми-тогенами при применении МБФ в концентрации 10-7 моль/мл не отличался достоверно от концентрации 5*10-8 моль/мл. Для вещества КД процент пролиферации МНК, стимулированных ФГА, анти-СБЭ и PWM составил 7,Э±Э,2%, 6,5±2,8%, и 9,4±4,Э% соответственно.
Учитывая полученные результаты, можно предположить, что МБФ и КД способны ин-гибировать тирозинкиназы, однако для таких заключений необходимы дополнительные исследования.
Таким образом, результаты экспериментов по изучению антипролиферативных эффектов МБФ и КД in vitro позволяют заключить следующее:
МБФ и КД в диапазоне концентраций 10-9-10-7 моль/мл дозозависимо подавляют пролиферацию митоген-активированных человеческих МНК в условиях in vitro. Однако, МБФ достоверно (p<0,05) активнее подавляет пролиферацию МНК, а, следовательно, является более интересным для дальнейшего изучения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кренски А., Штром Т., Блюстоун Дж. Иммуно-модуляторы: иммунодепрессанты, иммуностимуляторы и средства,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.