РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 4, с. 389-393
= МОЛЕКУЛЯРНАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК 57:539.12.08:615.849:591.813.577
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МЕТОД ДНК-ГАЛО ДЛЯ ОЦЕНКИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК, ИНДУЦИРОВАННЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ГЕНОТОКСИЧЕСКИМИ АГЕНТАМИ
© 2013 г. Н. М. Сметанина1, М. В. Пустовалова2, А. Н. Осипов2*
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва
С помощью модифицированного метода ДНК-гало проведена оценка уровней индуцированных од-нонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека, подвергшихся кратковременному (до 10 мин) воздействию рентгеновского излучения, перекиси водорода и длинноволнового ультрафиолетового излучения (365 ± 10 нм) in vitro. Показано, что зависимость доза—эффект в диапазоне доз рентгеновского излучения 0.3—2.0 Гр аппроксимируется линейной функцией у = 0.25 + 0.42x (R2 = 0.98), где у — индекс ДНК-гало в усл. ед., а x — доза облучения в Гр. В диапазоне 2—5 Гр наблюдался эффект "насыщения". При воздействии перекиси водорода вплоть до концентрации 25 мкмоль/л зависимость доза—эффект описывалась линейной функцией у = 0.23 + 0.033x (R2 = 0.96), где у — индекс ДНК-гало в усл. ед., а x — концентрация перекиси водорода в мкмоль/л. Воздействие УФ-излучения индуцировало линейное увеличение индекса ДНК в диапазоне доз 2—10 кДж/м2 (у = 0.26 + 0.032x (R2 = 0.99), где у — индекс ДНК-гало в усл. ед., а x — доза облучения в кДж/м2). В целом, описанная модификация метода ДНК-гало представляет собой простой, чувствительный, хорошо воспроизводимый и быстрый метод анализа од-нонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в живых клетках.
Однонитевые разрывы ДНК, метод ДНК-гало, рентгеновское излучение, ультрафиолетовое излучение, перекись водорода, лимфоциты.
DOI: 10.7868/S0869803113040164
Последние 30 лет ознаменовались стремительным развитием методов анализа повреждений ДНК в единичных клетках: метод ДНК-комет, иммунноцитохимия, TUNEL, проточная цито-метрия и т.д. Как наиболее простой, дешевый и не требующий наличия дорогостоящего оборудования для анализа большое распространение получил метод ДНК-комет или комета-тест (comet assay). С первоначальным своим названием "электрофорез ДНК единичных клеток в геле агарозы" он был впервые описан Ostling и Johanson в 1984 г. [1]. Метод получил свое второе название из-за того, что ДНК клеток, иммобилизованных в агарозу и затем лизированных, после проведения электрофореза с последующей ее окраской флуоресцентными красителями или серебром выглядела под микроскопом подобно кометам звездного неба. Высокомолекулярная, неповрежденная ДНК образовывала "ядро" кометы, а релаксированные петли и фрагменты ДНК мигрировали в геле ага-розы к аноду, создавая своеобразный "хвост". В 1988 г. Singh и соавторы, используя щелочную денатурацию и электрофорез ДНК при pH > 13, раз-
* Адресат для корреспонденции: 123182 Москва, ул. Живописная, 46, ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА; тел.: (499) 190-96-83; е-mail: andreyan.osipov@gmail.com.
работали высокочувствительную "щелочную" модификацию метода, позволявшую анализировать изменения количества однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК при дозах редкоионизирующего излучения всего 5—10 сГр [2]. В настоящее время существуют несколько десятков модификаций метода, позволяющих анализировать различные формы повреждений ДНК (одно- и двунитевые разрывы ДНК, модификация оснований, сшивки ДНК-ДНК/ДНК-белок и т.д.) и эффективность их репарации в практически любых клетках [3—6]. Однако помимо несомненных достоинств этого метода существует и серьезный недостаток, а именно существенная межлабораторная вариабельность результатов, полученных с использованием одной и той же модификации и в сходных экспериментальных условиях. Одной из причин этой вариабельности представляются различия в конструкциях элек-трофоретических камер, не позволяющие получить полностью идентичные параметры электрофореза. Для решения этой проблемы и упрощения самого метода Sestili и Cantoni в 1999 г. разработали метод "щелочного гало" (alkaline-halo assay) [7], позднее модифицированный и названный "быстрый метод гало" (fast halo assay)
390
СМЕТАНИНА и др.
[8,9]. Денатурированная в щелочных условиях фрагментированная ДНК быстро диффундировала в геле агарозы, создавая своеобразное гало вокруг "ядерной" области. Метод позволил оценивать изменения в количестве однонитевых разрывов ДНК без проведения электрофореза. Годом позже, независимо от итальянских исследователей, один из основных разработчиков щелочной версии метода ДНК-комет — Singh предложил использовать сходный метод, названный им метод "ДНК диффузии" (DNA-diffusion assay) для анализа апоптотической межнуклеосомной деградации ДНК [10]. Этот метод также включает в себя стадию щелочной денатурации ДНК, что может приводить к артефактовой оценке клеток с высоким количеством однонитевых разрывов ДНК как апоптотических.
Целью настоящей работы была разработка собственной модификации метода щелочного гало для дальнейшего упрощения и стандартизации метода. Предложенная нами модификация метода ДНК-гало состоит в существенном изменении оригинальных условий иммобилизации клеток в агарозу, их лизиса, щелочной денатурации ДНК, окраски и системы визуальной оценки гало. С использованием разработанной модификации проведены исследования индуцированных однони-тевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека, подвергшихся кратковременному (до 10 мин) воздействию рентгеновского излучения, перекиси водорода и длинноволнового (ближнего) УФ-излучения (по международной классификации — UVA) in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Для исследований использовали кровь мужчин-доноров в возрасте 23—35 лет. Забор периферической крови проводили в К2ЭДТА-вакутейне-ры (Vacuette).y всех доноров было получено согласие на проведение данного исследования.
Выделение лимфоцитов проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин (Histopaque-1077, Sigma) в соответствии с прилагаемой инструкцией. После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензировали в фосфатно-солевом буфере до конечной концентрации 1 х 106 клеток/мл.
200 мкл суспензии клеток смешивали с 600 мкл 1%-ного раствора легкоплавкой агарозы (Thermo Scientific, TopVision Low Melting Point Agarose) в фосфатно-солевом буфере (рН 7.4) при температуре 37.5°С. 75 мкл полученной смеси наносили на предварительно покрытые слоем 1%-ной нор-моплавкой агарозы предметные стекла, накрывали покровными стеклами и оставляли на 10 мин при 4°C до образования плотного геля.
Слайды с иммобилизованными в агарозу клетками помещали в холодный (4°С) фосфатно-со-левой буфер (рН 7.4). Жизнеспособность клеток контролировали с помощью двойной флуоресцентной окраски акридиновым оранжевым и йодистым пропидием согласно общепринятой методике [11]. В этих условиях клетки сохраняли жизнеспособность (не более 5% погибших клеток) в течение нескольких часов. Время самих экспериментов не превышало 15 мин.
Клетки подвергали воздействию рентгеновского излучения в дозах 0.33, 0.6, 1, 2 и 5 Гр на рентгеновской биологической установке РУБ РУСТ-М1 (Россия) при мощности дозы 0.85 Гр/мин, напряжении 200 кВ, токе 2—5 мА, фильтре 1.5 мм Al, и температуре 4°C (для охлаждения использовались термогранулы LAB ARMOR BEADS).
Для обработки лимфоцитов перекись водорода 30% Н2О2 (Sigma-Aldrich) разводили в фосфат-но-солевом буфере (рН 7.4) до конечной концентрации 1, 2, 5, 10, 25 и 50 мкмоль/л и инкубировали 5 минут при 4°С.
Клетки подвергали воздействию УФ-излуче-ния с использованием установки BLX-365 (BioLink, длина волны 365 ± 10 нм). Облучение клеток при температуре 4°C проводилось в дозах 2, 5 и 10 кДж/м2. Интенсивность излучения — 2.92 кДж/м2 за 1 мин.
Сразу (10—15 с) после облучения или инкубации с Н2О2 агарозные слайды переносили в холодный (4°C) лизирующий буфер (2.5 моль/л NaCl, 100 ммоль/л Na2EDTA, 20 ммоль/л Tris-HCl, pH 10.0, 1% Triton X-100 и 10% DMSO) и выдерживали в течение 1 ч в темноте при 4°C. После лизиса клеток слайды переносили в холодный (4°C) щелочной раствор (300 ммоль/л NaOH, 2 ммоль/л EDTA-Na2, рН > 13) и выдерживали 20 мин для расплетания (щелочной денатурации) нитей ДНК. После инкубации в щелочном буфере проводили нейтрализацию для ренатура-ции (восстановления двунитевой структуры) ДНК (3-кратная промывка в трис-боратном буфере, рН 8.2). Затем слайды промывали дистиллированной водой и фиксировали в 70%-ном этаноле в течение 10 мин.
Для окраски ДНК использовали SybrGreen I (Invitrogen). Визуализацию ДНК-гало проводили с помощью люминесцентного микроскопа Лю-мам Р-8" (ЛОМО, Россия) с использованием системы визуализации микрофотоизображений "Микромед-1600-3ф" (ЛОМО, Россия). На каждом слайде регистрировали по 100 нуклеоидов. На каждую точку обрабатывали по 3 слайда от каждого донора. В зависимости от степени диффузии ДНК нуклеоиды относили к одному из трех классов: А — отсутствие гало; Б — гало присутствует, но при этом размеры и интенсивность флуо-
Рис. 1. Микрофотографии различных классов ДНК-гало лимфоцитов периферической крови человека: А — отсутствие гало; Б — гало присутствует, но при этом размеры и интенсивность флуоресценции ядерной области меняются незначительно; В — максимальная выраженность гало, большая часть ДНК фрагментирована.
ресценции ядерной области меняются незначительно; В — максимальная выраженность гало, большая часть ДНК фрагментирована. Микрофотографии нуклеоидов всех вышеперечисленных классов представлены на рис. 1. Индекс ДНК-гало рассчитывали по формуле ИДГ = (0 х х пА + 1 х пБ + 2 х пВ)/Е, где пА, пБ и пВ — число нуклеоидов в категориях А, Б и В, а Е — сумма всех подсчитанных нуклеоидов.
Результаты исследований представлены как среднее арифметическое результатов трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 2 представлены усредненные результаты исследований изменений индекса ДНК-гало в лимфоцитах периферической крови человека, подвергшихся воздействию рентгено
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.