ЗООЛОГИЧЕСКИМ ЖУРНАЛ, 2004, том 83, № 10, с. 1270-1274
МЕТОДИКА ЗООЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
УДК 577.113
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ БЕЗ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК И ЕГО ПРЕИМУЩЕСТВА
© 2004 г. О. Г. Сиделева, Ю. А. Смирнова, Н. Б. Ананьева
Зоологический институт РАН, С.-Петербург 199034 e-mail: azemiops@zin.ru Поступила в редакцию 30.01.2003 г.
Предложена модификация полимеразной цепной реакции (ПЦР) для рептилий без предварительного выделения ДНК, успешно применяющаяся в генетике человека. Подробно изложен протокол эксперимента. Применение метода к герпетологическим объектам особенно перспективно при по-пуляционно-генетических исследованиях, требующих больших выборок, а также при изучении редких и охраняемых видов животных.
Работы в области молекулярной систематики рептилий в нашей стране немногочисленны, большая часть их касается определения так называемых RAPD-маркеров методом полимеразной цепной реакции (ПцР) по стандартной методике. Наиболее значим цикл работ, в котором на базе этого метода проведено исследование генетического родства в группе двуполых и однополых видов ящериц семейства настоящих ящериц (La-certidae) и гибридогенного происхождения однополых видов (Гречко и др., 1998; Рябинина и др., 1998; Чобану и др., 2002; Ryabinina et al., 1999).
Для изучения систематики, филогении и генетического разнообразия популяций различных животных все чаще используются ДНК-маркеры, выявляемые методом ПЦР, т.е. методом амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенные последовательности ДНК в количестве, превышающем исходное в 108 раз (Анализ генома, 1990).
В качестве генетических маркеров в RAPD-анализе используются фрагменты ДНК, образующиеся в результате ПЦР с универсальными, случайно амплифицирующимися праймерами. Полученные фрагменты могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном геле, при этом характеристикой индивида является молекулярная масса ДНК-бандов, а также их число. RAPD-анализ - это определение, как правило, внутривидовой изменчивости по числу копий и длине фрагментов геномной ДНК, образующихся после проведения ПЦР.
Впервые в герпетологических исследованиях нами была использована методика проведения ПЦР без предварительного выделения ДНК, успешно применяющаяся в генетике человека (Иващенко и др., 2001). Предложенная модификация ПЦР была опробована на змеях, а также
адаптирована к универсальным, случайно ампли-фицирующимся праймерам (ЯЛРВ). Для постановки ПЦР достаточно 1-2 капель крови животного, что является щадящей процедурой при проведении популяционных исследований, требующих больших выборок, а также при изучении редких и охраняемых видов рептилий.
Отказ от предварительной ДНК-экстракции позволил в 2 раза сократить время, необходимое для генотипирования объекта и снизить затраты на реактивы. Пятна крови, нанесенные на фильтровальную бумагу, после высушивания на воздухе не требуют специальных условий хранения. Нами были получены хорошие результаты ПЦР при использовании фильтров с пятнами крови, хранившихся при комнатной температуре в лаборатории в течение нескольких лет. Образцы крови, нанесенные на фильтровальную бумагу, легко хранить и транспортировать в полевых условиях, их можно пересылать по почте, что облегчает обмен материалом между лабораториями. К недостаткам метода относятся: большее число единиц Taq-ДНК-полимеразы, необходимое для успешной амплификации фрагментов ДНК, а также слабая амплификация наиболее длинных фрагментов ДНК (2.5-3.0 тыс. пар оснований). В представленном исследовании основной диапазон ДНК-маркеров находился в пределах 150-1000 п.о., поэтому результаты ПЦР без предварительной ДНК-экстракции полностью совпадают с традиционным методом.
Материалом для данной работы послужили экземпляры змей (15) - лазающих полозов рода Е1арНв (Е. ¿1опе, Е. дыаШогНпеМа), из лабораторного разведения в экзотариуме г. Тулы. Кровь отбирали из хвостовой вены инсулиновыми шприцами. Несколько капель крови из шприца наносили на фильтровальную бумагу и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для фикса-
ции наиболее удобны обычные круглые фильтры или кусочки (6 х 6 см) мягкой фильтровальной бумаги. В полевых условиях можно использовать обычные бумажные салфетки (желательно, чтобы капли крови на фильтре совпадали друг с другом, хорошо пропитывая фильтр). Каждый образец должен храниться так, чтобы он не соприкасался с другими - его хранят в отдельном полиэтиленовом пакетике или завернутым в чистую бумагу. Использовать полученный таким образом материал для выделения ДНК можно по методике, описанной ниже.
Выделение ДНК из пятен крови
Эта процедура имеет следующие последовательные этапы:
1. Измельчали примерно 1 см2 фильтровальной бумаги, пропитанной кровью и высушенной на воздухе при комнатной температуре.
2. Полученную кашицу переносили в пробирки эппендорф объемом 1.5 мл и добавляли буфер для протеиназы К (10 мМ Tris HCl pH = 7.5, 75 мМ NaCl, 25 мМ EDTA) 10%-ный додецилсульфат Na (SDS) до конечной концентрации 0.5% и маточный раствор протеиназы К в концентрации 20 мг/мл (конечная концентрация в растворе -250 мкг/мл), общий объем смеси равнялся 400 мкл.
3. Смесь инкубировали с протеиназой К в течение 12 ч при t = 37°C, либо в течение 3 ч при t = 55°C.
4. В смесь добавляли 400 мкл забуференного фенола, осторожно перемешивали в течение 10 мин и центрифугировали при 5000 об/мин 5 мин.
5. Верхнюю фазу переносили в новый эппендорф объемом 1.5 мл и добавляли 400 мкл раствора фенол : хлороформ (1 : 1). Перемешивали в течение 10 мин и центрифугировали при 5000 об/мин 5 мин.
6. Верхнюю фазу повторно переносили в новый эппендорф объемом 1.5 мл и добавляли 400 мкл хлороформа. Перемешивали в течение 10 мин и центрифугировали при 5000 об/мин 5 мин.
7. Верхнюю фазу раствора ДНК еще раз переносили в новый эппендорф объемом 1.5 мл и добавляли последовательно 40 мкл 3 М ацетата Na (1/10 объема) и 800 мкл охлажденного 96%-ного этилового спирта (2 объема).
8. Раствор осторожно перемешивали, наблюдая преципитацию ДНК. Центрифугировали при 12000 об/мин 10 мин.
9. Осадок ДНК промывали раствором 70%-но-го этилового спирта для удаления солей и центрифугировали при 12000 об/мин 5 мин.
10. Осадок ДНК высушивали при комнатной температуре и растворяли в 50 мкл ТЕ буфера (состав ТЕ буфера: 10 мМ Tris HCl pH 7.4; 1 мМ EDTA pH 8.0).
Концентрация ДНК (мкг/мл), выделенной из различных тканей полозов
а Ткань, тип фиксации
Номер экземпляр Вид Кровь, фильтровальная бумага Кровь, спирт 96% Мышцы, спирт 96%
I Elaphe quatuorlineata (г. Волгодонск)* 0.273 0.156 -
II E. dione (г. Уссурийск)* 0.200 0.220 -
III E. quatuorlineata (Армения)** 0.248 0.250 0.234
* Живые экземпляры. ** Погибший экземпляр.
Концентрация ДНК в образцах Elaphe quatuor-lineata и E. dione, выделенных из различных тканей полозов (таблица), определена на спектрофотометре фирмы "Eppendorf" (таблица). Эти результаты свидетельствуют о том, что количество ДНК, выделенной из 1 см2 пропитанных кровью фильтров, практически соответствует концентрации ДНК, полученной из 0.05 см3 фиксированной в этаноле периферической крови или мышечной ткани.
5 6 7
Рис. 1. Аналитический форез - образцы ДНК, выделенные из различных тканей лазающих полозов. Дорожки: 1, 3 - образцы ДНК экземпляров I, II, выделенные из пятен крови на фильтровальной бумаге; 2, 4, 5 - ДНК из образцов крови экземпляров I—III, фиксированных в 96%-ном этиловом спирте; 6 - ДНК крови из экземпляра III, выделенная из фиксированной в спирте мышечной ткани, 7 - маркер-ДНК фага X, обработанная рестриктазами EcoRI и HindIII (экземпляры I-III - см. таблицу).
1272
СИДЕЛЕВА и др.
I
Рис. 2. Схема последовательных операций при проведении ПЦР без выделения ДНК: 1 - забор крови у полоза, 2 - помещение крови на фильтр, 3 - перенос измельченного фрагмента фильтра в пробирку эппендорф, 4 - работа на амплификаторе, 5 - электрофорез.
На рис. 1 представлены результаты аналитического электрофореза образцов ДНК, выделенных из пятен крови, высушенных на фильтровальной бумаге (дорожки 1, 3), из крови, фиксированной в 96%-ном этиловом спирте (дорожки 2, 4, 5) и ДНК, выделенной из фиксированной в спирте мышечной ткани (6). Образцы ДНК, выделенные по описанной выше методике, не отличаются от тотальной ДНК, полученной из тканей, фиксированных в 96-ном этаноле.
Полимеразная цепная реакция
Амплификацию in vitro с универсальными праймерами осуществляли по стандартной методике (Sambrook et al., 1989) с собственными моди-
фикациями (то есть без предварительной ДНК-экстракции) (рис. 2).
1. В заранее подписанную пробирку эппендорф объемом 1.5 мл помещали фрагмент фильтра, пропитанного кровью змеи, размером приблизительно 1 х 1 мм. Фрагмент отделяли пинцетом, стерилизованным перед каждым новым образцом.
2. Смешивали следующие компоненты
Из расчета 22 мкл на каждый образец:
- 1 мМ смеси четырех дезоксинуклеотидтри-фосфатов (ёШР);
- 6.7 мМ М§С12;
- 1 ед. активности ДНК-полимеразы ТИегшш ШегшорЫШ;
4
5
12 3 4
Рис. 3. Электрофореграмма, демонстрирующая результаты ПЦР с универсальным праймером L-45. Дорожка 1 - маркер (ДНК фага X, обработанная рест-риктазами EcoRI и HindIII); 2 - ДНК, выделенная из периферической крови, фиксированной в 96% этаноле; 3 - ДНК, выделенная из пятен крови, фиксированных на фильтровальной бумаге; 4 - E. dione (г. Уссурийск), ПЦР без предварительной ДНК-экстракции (экземпляр II - см. таблицу).
- 1/10 часть объема 10хбуфера для Taq-поли-меразы, предоставленного фирмой-производителем фермента ("Росниигенетика", Москва)
- 25 пМ универсального праймера. Мы использовали универсальные праймеры АА2М2 (5'-GAG CGA CCC AGA GCG G-3') и L-45 (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'), разработанные Булатом с соавт. (Bulat et al., 1996).
- дистиллированной воды до конечного объема 22 мкл.
3. ПЦР проводили при следующих условиях: после денатурации (94°C, 6 мин) устанавливали 32 цикла амплификации в режиме 94°C - 1 мин (денатурация); 55°C - 1 мин (отжиг праймеров); 72°C - 1 мин 15 с (синтез). Последний си
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.