РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2007, том 1(10), № 2, с. 176-179
— ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ —
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ РЕТИНАЛЬНОГО S-АНТИГЕНА ДЛЯ ИФА-ДИАГНОСТИКИ УВЕОРЕТИНИТОВ
© 2007 г. Л.Р. Хорошева1, Т.В. Гаврилова3, В.А. Черешнев2, М.В. Черешнева2, С.Ю. Родионов2, С.В. Сибиряк2, Д.А. Суховая1, Е.Г. Орлова1
1 ЗАО «Институт новых медицинских технологий», Пермь, Россия; 2 Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург, Россия; 3 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
Поступила: 23.12.06 г. Принята: 28.01.07 г.
Разработан метод выделения S-антигена для ИФА-диагностики увеоретинитов с использованием последовательного сульфат-аммонийного осаждения и гель-фильтрации, позволяющий существенно повысить чистоту и количество конечного продукта.
Ключевые слова: увеоретиниты, S-антиген
ВВЕДЕНИЕ
Ретинальный S-антиген является водорастворимым белком с молекулярной массой 48 — 50 кДа с высоким содержанием неполярных аминокислот [1, 2, 8, 9]. S-антиген (ретинальный аррестин, S-АГ) присутствует в фоторецепторах сетчатки глаза и участвует в процессах визуальной трансдукции. S-АГ «увеитогенный» белок, — иммунизация животных S-АГ приводит к развитию увеита, а выявление аутоантител против S-АГ в сыворотке (с помощью реакций пассивной гемаг-глютинации при технологии иммунофер-ментного анализа) считается информативным методом диагностики и клинического мониторинга увеоретинитов [3 — 6].
Используемые ранее способы выделения и очистки Б-антигена, пригодного для разработки ИФА отличались технологической сложностью, трудоемкостью и зачастую не обеспечивали необходимую чистоту и выход получаемого препарата, предполагали использование этапа дополнительной очистки белка с помощью ионообменной или гидрофобной адсорбционной хроматографии [1, 7 — 9]. Целью настоящей работы явилось разработать метод выделения ретинального БАГ из сетчатки глаз крупного рогатого скота,
Адрес: 620000 Екатеринбург, ул. Первомайская, д. 91. E-mail: m.chereshneva@iip.uran.ru
позволяющий повысить чистоту и выход получаемого продукта и, тем самым, исключить необходимость проведения стадии дополнительной очистки продукта.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экстракция Б-антигена из сетчатки
Б-АГ выделяли из сетчатки глаз крупного рогатого скота. Предварительно полученную и замороженную (-70°С) ретинальную ткань крупного рогатого скота массой 25 г, размораживали и гомогенизировали. Экстракцию белков проводили дважды при температуре 4°С 0,05 М Трис-НС1 буферным раствором (рН 7,6), содержащем 0,04% азида натрия (буфер 1), в течение 12 часов при интенсивном перемешивании. При первом экстрагировании на 1 г сетчатки использовали 3 мл буфера, при втором — 1 мл. После центрифугирования в течение 1 часа при 5700 х д суперна-танты собирали, а осадок реэкстрагировали. Затем супернатанты после первого и второго центрифугирования объединяли.
Сульфат-аммонийное фракционирование
Фракционирование проводили дробным методом в три этапа. На первом этапе экстракт насыщали до 20% насыщенным раствором сульфата аммония (рН 7,2) и выдержива-
Рис. 1. Хроматограмма процесса выделения S-АГ методом гель-фильтрации на геле Sephacryl S-200:
1. Первая фракция, 50 мл;
2. Вторая фракция (содержащая S-антиген), 26 мл;
3. Третья фракция, 101 мл.
ли при 4°С в течение ночи. После центрифугирования в течение 2 часов при 5700 х g су-пернатант декантировали, а осадок отбрасывали и в работе не использовали. На втором этапе содержание сульфата аммония в супер-натанте доводили до 50% и выдерживали в аналогичных условиях, центрифугировали при 5700 х g в течение 2 часов. Полученный осадок растворяли в минимальном количестве буфера 1. Второй этап повторяли дважды.
Гель-фильтрация
Колонку (25 х 100) с Sephacryl S-200 Superfine (Pharmacia, Sweden) «упаковывали» буфером 1 со скоростью 2,5 мл/мин. Пробу объемом 5—15 мл (что составляет 2 — 3% от объема колонки) наносили на колонку со скоростью 0,2 — 0,3 мл/мин. Нанесение и элюи-рование (тем же буфером) проводили под контролем проточного УФ-детектора (AktaPrime, Amersham Biosciences, Sweden) при длине волны 280 нм и температуре 4°С. Фракции, содержащие S-антиген, коллекционировали. Определение количества общего белка проводили по методу Бредфорда. Идентификацию и определение количества S-ан-тигена проводили методом иммунотурбиди-метрии [10, 11] с использованием гипериммунной сыворотки против S-АГ, полученной путем иммунизации кроликов S-АГ крупного рогатого скота, выделенного по методу, предложенному Яковлевой В.Г. [7], с последующим контролем специфичности сыворотки.
Молекулярную массу и электрофоретиче-скую чистоту получаемого препарата S-анти-гена оценивали стандартным методом электрофореза в полиакриламидном геле (10%) в денатурирующих условиях с применением додецилсульфата натрия.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖЕНИЕ
В качестве основы для разработки предлагаемого метода получения S-антигена был использован способ, описанный Яковлевой В.Г. [3], как наиболее технологически доступный, обеспечивающий достаточный выход конечного продукта.
Нами использовано последовательное трехступенчатое сульфат-аммонийное фрак-
Рис. 2. Электрофорез фракций, полученных при гель-
фильтрации в процессе выделения S-АГ
М — Маркеры для электрофореза (Pharmacia)
Phosphorylase b мол. вес 94,000 кДа
Albumin мол. вес 67,000 кДа
Ovalbumin мол. вес 43,000 кДа
Carbonic Anhydrase мол. вес 30,000 кДа
Trypsin Inhibitor мол. вес 20,100 кДа
а — Lactalbumin мол. вес 14,400 кДа
S-1 После первого 50% осаждения (растворенный осадок)
S-2 После второго 50% осаждения (растворенный осадок)
S-3 Нанесено на колонку с Sephacryl S200
1 — первая фракция, полученная при гель-фильтрации
2 — вторая фракция, полученная при гель-фильтрации.
178
Л.Р. Хорошева и др.
Таблица 1. Оценка количества S-АГ и концентрации общего белка на разных этапах выделения
Проба Объем S-АГ Общий белок Соотноше-
пробы,мл мг/мл в объеме, мг мг/мл в объеме, мг ние S-АГ/белок
Этапы экстракции S-антигена при сульфат-аммонийном осаждении
После первого 50% 50 1,34 67 4,72 236 0,28
осаждения
После второго 50% 50 1,26 63 3,60 180 0,36
осаждения
После третьего 50% 11 5,45 60 15,64 172 0,36
осаждения (Нанесено
на колонку с
Sephaayl S200)
Фракции, полученные при гель-фильтрации
Первая фракция 50 0,72 36 1,80 90 0,40
Вторая фракция 26 0,62 16 0,77 20 0,80
Третья фракция 101 0,01 1 0,44 45 0,02
ционирование экстракта, позволяющее уменьшить количество контаминирующих белков. Так 20% насыщение экстракта S-анти-гена раствором сульфата аммония на первом этапе с последующим центрифугированием избавляет от тяжелых белков с молекулярной массой 150 и более кДа. Последующее насыщение полученного супернатанта сульфатом аммония до 50% приводит к обратимой денатурации фракции альбуминов, содержащей S-антиген, которая после центрифугирования растворяется в буфере 1 и повторно подвергается 50%-ному насыщению раствором сульфата аммония. Повторное (третий этап) осаждение используется для избавления от «сооса-дившихся» белков при предыдущем 50% насыщении.
Для дальнейшего выделения S-антигена из полученного на предыдущих стадиях экстракта использовали гель-фильтрацию, которую осуществляли параллельно на двух видах сорбентов Sephadex G-100 (Pharmacia, Sweden) и Sephacryl S-200 Superfine (Pharmacia, Sweden) в колонках с одинаковыми параметрами — 25х 100.
При работе с сорбентом Sephadex G-100 фракционирование не произошло в силу того, что разделительная способность геля оказалась недостаточной и ожидаемых результа-
тов по выделению белковых фракций выявлено не было. Использование же в качестве сорбента Sephacryl S-200 Superfine для проведения гель-фильтрации позволило выделить S-АГ. Хроматограмма процесса представлена на рис. 1. На колонку, упакованную Sephacryl S-200 Superfine наносили 11 мл пробы с содержанием белка 172 мг со скоростью 0,3 мл/мин. Процессы нанесения и элюиро-вания контролировали с помощью проточного УФ-детектора при длине волны X = 280 нм. В результате в процессе гель-фильтрации было получено три белковых фракции, отличающиеся по величине оптической плотности. Результаты по определению количества S-ан-тигена и концентрации общего белка на разных этапах выделения суммированы в таблице 1. Данные по оценке молекулярной массы и электрофоретической чистоте фракций, полученных на этапах экстракции и очистки S-антигена, представлены на рис. 2.
Как иллюстрирует рис. 2, на электрофоре-грамме во второй фракции, полученной при гель-фильтрации, обнаруживается одна «мажорная» полоса S-АГ с молекулярной массой 48-50 кДа. Электрофоретическая чистота полученного белка составляет 80% (по соотношению S-антиген/общий белок) и более. Специфичность полученного S-АГ под-
тверждена в реакции преципитации (имму-нотурбидиметрия) с использованием антител к S-АГ.
Таким образом, предлагаемый вариант выделения и очистки S-антигена позволяет получить конечный продукт с высоким выходом и чистотой, пригодный для применения в им-муноферментном анализе.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Daniel A. Beneski, Larry A. Donoso et al. Human Retinal S-antigen. Invest. Ophthal. Vis. Sci. 1984, 25, 686-690.
2. Palczewski K. Structure and functions of arrestins. Protein Science 1994, 3, 1355-1361.
3. Слепова О.С. Органоспецифический аутоим-мунитет при воспалительной патологии сетчатки и увеального тракта. Aвтореф. дисс. докт. биол. наук. М. 1991. 48.
4. Слепова О.С. Нарушения в иммунной системе организма при заболеваниях глаз. Основные принципы иммунологических исследований в
офтальмологической практике. Вестн. Уральской мед. акад. науки 2005, 1, 24 — 30.
5. Shinohara T., Singh V., Tsuda M. et al. S-antigen: from gene to autoimmune uveitis. Exp. Eye Res. 1990, 50, 751-757.
6. Streilein J. Ocular immune privilege: the eye takes a dim but practical view of immunity and inflammation. J. Leuc. Biol. 2003, 74, 179-185.
7. Яковлева В.Г. Твердофазная иммунофермент-ная тест-система для выявления антител к ре-тинальному S-антигену и ее использование в комплексном иммунологи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.