ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 3, с. 305-315
УДК 577.27
МОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ПУЛА БТШ70 НА ПРОДУКЦИЮ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ПОПУЛЯЦИЯХ ФАГОЦИТОВ
© 2015 г. Н. И. Троянова#, М. А. Шевченко, А. А. Бойко, Р. Р. Мирзоев, М. А. Перцева, Е. И. Коваленко, А. М. Сапожников
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 26.09.2014 г. Принята к печати 22.12.2014 г.
Активные формы кислорода (АФК), продуцируемые фагоцитирующими клетками системы врожденного иммунитета, играют важную роль в первой линии защиты организма от болезнетворных микроорганизмов. Основным источником АФК у всех разновидностей фагоцитирующих клеток является мем-браноассоциированный мультимолекулярный комплекс МАОРН-оксидазы (КФ 1.6.3.1). Процесс формирования этого комплекса и его активность зависят от многих факторов, способных как усиливать, так и подавлять интенсивность генерации АФК. Вместе с тем, в последние годы появляется все больше свидетельств о существовании малоизученных механизмов ограничения продукции АФК фагоцитами, направленных на защиту собственных тканей от повреждающего действия кислородных радикалов в очагах воспаления. Наши предыдущие данные и результаты работ других авторов указывают на то, что одно из звеньев этой системы ограничения может быть связано с иммуномодулирующей активностью внеклеточного пула белков теплового шока 70 кДа (БТШ70). В настоящей работе использован ряд клеточных моделей с применением ингибиторов МАОРН-оксидазы для анализа возможной связи механизмов супрессирующего действия БТШ70 на продукцию АФК фагоцитами и взаимодействия БТШ70 с субъединицами данного ферментного комплекса. Полученные результаты подтвердили литературные сведения о способности экзогенных БТШ70 модулировать активность МАОРН-оксидазы и впервые продемонстрировали ингибирующее действие этих протеинов на интенсивность генерации АФК во внутриклеточном пространстве фагоцитов.
Ключевые слова: нейтрофилы, активные формы кислорода, ЖЛОРН-оксидаза, белки теплового шока.
DOI: 10.7868/S0132342315030094
ВВЕДЕНИЕ
Способность к интенсивной продукции активных форм кислорода (АФК) является одной из важных особенностей профессиональных фагоцитов, в частности нейтрофилов и макрофагов, позволяющей этим эффекторам системы врожденного иммунитета осуществлять защиту организма от патогенных микроорганизмов. Основным источником АФК, продуцируемых фагоцитирующими клетками в окружающее пространство и генерируемых в их фагосомах для разрушения микроорганизмов, является МАОРН-оксидаза (КФ 1.6.3.1),
Сокращения: АФК — активные формы кислорода, БСА — бычий сывороточный альбумин, БТШ70 — белок теплового шока 70 кДа, КМ — костный мозг, ЛПС — липополиса-харид, Apo — апоцинин, DCF-DA — 2',7'-дихлорфруорес-цеиндиацетат, DPI — дифенилиодоний, fMLP — формил-метионил-лейцил-фенилаланин, NOX — NADPH-оксидаза.
#Автор для связи (тел.: +7 (495) 330-40-11; эл. почта: troyanatali@gmail.com).
представляющая собой мембраноассоциирован-ный мультикомпонентный ферментный комплекс. Главным продуктом активности МАОРН-оксидазы, является супероксид-анионрадикал
(02-) — предшественник ряда других разновидностей АФК, в частности, пероксида водорода (Н2О2), гипохлорита (СЮ-) и радикала гидрокси-ла (НО). В настоящее время в клетках разных типов идентифицировано семь разновидностей указанных ферментов Мох1—Мох5, Оиох1, Оиох2; экспрессия Мох1 характерна для моноцитов и тканевых макрофагов, а Мох2 — для нейтрофилов [1]. Мох2 — наиболее изученная форма МАОРН-оксидазы, поскольку АФК, продуцируемые активированными нейтрофилами, играют важную роль в первой линии защиты организма от болезнетворных микроорганизмов. Факторы, продуцируемые клетками хозяина и патогена в процессе инфицирования, стимулируют циркулирующие в крови нейтрофилы, приводя к их ми-
грации к источнику инфицирования и к активации механизмов противомикробной защиты, в частности, к интенсивной сборке комплексов МАЭРН-оксидазы.
Интенсивность формирования данных молекулярных комплексов, а также эффективность продукции этими ферментами АФК, находятся под специальным контролем и зависят от многих факторов, значительная часть которых уже охарактеризована. В то же время хорошо известно, что АФК, образующиеся в местах скопления ней-трофилов в повышенной концентрации, оказывают повреждающее действие не только на патогенные микроорганизмы, но и на клетки-продуценты кислородных радикалов и на другие ткани организма. Установлено, что в очагах воспаления суммарная концентрация АФК, продуцируемых в процессе так называемого "окислительного взрыва" фагоцитов, может достигать 50—100 мкМ [2]. Очевидно, что несмотря на достаточно эффективные механизмы антиоксидантной защиты, в организме должна быть предусмотрена регуляторная система, направленная на ограничение избыточной продукции АФК в очагах воспаления с целью предотвращения нежелательных повреждений собственных тканей. Некоторые малоизученные звенья системы ограничения уровня продукции фагоцитами АФК могут быть связаны с внеклеточным пулом БТШ70. Об этом свидетельствуют наши предыдущие данные [3] и результаты, опубликованные другими авторами [4].
Семейство БТШ70, содержащее четыре основных разновидности этих протеинов (индуцируемая и конститутивная формы цитоплазматического белка и две разновидности БТШ70, локализующиеся в эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях), относится к суперсемейству стресс-индуци-руемых белков теплового шока, локализующихся во внутриклеточном пространстве и выполняющих протективные и обслуживающие (шаперонные) функции в отношении многих других внутриклеточных протеинов [5].
В последние годы было опубликовано много работ, демонстрирующих присутствие в сыворотке периферической крови человека и лабораторных животных циркулирующего пула внеклеточных БТШ70, в основном его индуцируемой и конститутивной форм [6]. Было показано, что содержание сывороточных БТШ70 значительно возрастает при ряде заболеваний и в условиях стресса [7, 8]. Поиск источников внеклеточных БТШ70, а также изучение причин и механизмов их секреции находятся на начальной стадии. Неохарактеризованны-ми остаются и функции циркулирующего в организме сывороточного пула БТШ70. В то же время было высказано предположение о том, что появление внеклеточной формы БТШ70 является сигналом тревоги для иммунной системы, указывающим
на возникновение и локализацию неблагоприятных для организма стрессиндуцированных процессов [6]. Установлено также, что экзогенные внеклеточные БТШ70 обладают уникальными иммуностимулирующими свойствами. В частности, они активируют антигенпредставляющее звено иммунной системы [9], стимулируют цитотоксиче-скую активность натуральных киллеров [10] и продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками [11].
Однако, несмотря на большое число работ, посвященных указанной тематике, взаимодействие БТШ70 с различными звеньями иммунной системы остается малоизученным. В наших предыдущих исследованиях, предпринятых с целью расширения существующих представлений об имму-номодулирующих эффектах внеклеточных БТШ70, было продемонстрировано ингибирующее действие экзогенных БТШ70 на амплитуду "окислительного взрыва" нейтрофилов человека в модели фагоцитоза этими клетками опсонизированного зимозана [3]. Впоследствии этот эффект, а также возможность взаимодействия БТШ70 с субъединицами МАЭРН-оксидазы были продемонстрированы в работах других авторов [4, 12, 13].
В то же время механизмы зарегистрированного регулирующего действия внеклеточных БТШ70 на продукцию АФК фагоцитами остаются неизученными. Одним из основных и давно высказанных предположений о возможных причинах указанного ингибирующего эффекта БТШ70 является взаимодействие этого протеина с МАЭРН-окси-дазой [14]. Для оценки такой возможности в настоящей работе было проанализировано модулирующее действие ингибиторов ферментативной активности МАЭРН-оксидазы на регистрируемые эффекты БТШ70 в ряде моделей, позволяющих проводить исследование влияния экзогенных БТШ70 на процессы спонтанной и индуцированной генерации АФК в популяциях фагоцитирующих клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве первой, наиболее простой и чувствительной модели для проведения анализа механизмов модулирующего действия внеклеточного пула БТШ70 на процессы генерации АФК мы выбрали культуру клеток костного мозга (КМ) мыши, характеризующихся высоким уровнем продукции кислородных радикалов [20]. В наших экспериментах использовались как образцы очищенной фракции нейтрофилов, изолированной из суспензии клеток КМ с помощью магнитной сепарации, так и клетки, остающиеся после отделения нейтрофилов и содержащие фагоциты других типов, в частности моноцитарного ряда. Про-точно-цитометрический анализ показал, что содер-
жание нейтрофилов в обогащенной фракции составляло не менее 98%. В качестве активирующего фактора, приводящего к лавинообразной продукции клетками АФК ("окислительному взрыву") в опытах применяли пептид ШЬР (^-формилмети-онил-лейцил-фенилаланин), хемоаттрактант бактериального происхождения, способный вызывать дегрануляцию и продукцию АФК в фагоцитирующих клетках [17]. В качестве экзогенного БТШ70 в экспериментах использовали рекомбинантную индуцируемую форму БТШ70 человека, очищенную от примесей бактериальных липополисахаридов; контрольным белком являлся бычий сывороточный альбумин, схожий по физико-химическим характеристикам с БТШ70. Уровень продукции АФК измеряли с помощью метода люминолзависимой хемилюминесценции, широко применяемого для анализа кинетики "окислительного взрыва", индуцируемого активацией фагоцитов различными растворимыми факторами или контактом этих клеток с корпускулярным субстратом, запускающим процесс фагоцитоза [15]. Однако, в отдельных экспериментах наряду с люминолом использовался изолю-минол, не проникающий, в отличие от люминола, в клетки, что обеспечивало регистрацию не суммарного уровня люминесценции в анализируемых образцах (определяемого общим содержанием АФК во внутри- и внеклеточном пространстве), а лишь ее составляющей, оп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.