НЕЙРОХИМИЯ, 2009, том 26, № 2, с. 143-148
КЛИНИЧЕСКАЯ НЕЙРОХИМИЯ
УДК 577.352
МОДУЛЯТОРЫ АКТИВНОСТИ ЦИСТЕИНОВЫХ ПРОТЕАЗ И МАРКЕРЫ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ В СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ ПАЦИЕНТОВ С БОКОВЫМ АМИОТРОФИЧЕСКИМ СКЛЕРОЗОМ
© 2009 г. Л. В. Брылев1' 2, Е. Н. Нелькина1' 2, А. А. Яковлев2, М. В. Онуфриев2, А. А. Шабалина1, М. В. Костырева1, М. Н. Захарова1, И. А. Завалишин1, Н. В. Гуляева2*
Учреждение РАМН Научный центр неврологии РАМН, Москва 2Лаборатория функциональной биохимии нервной системы, Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии, РАН, Москва
Боковой амиотрофический склероз - неуклонно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся избирательным повреждением мотонейронов головного и спинного мозга. Целью нашей работы был поиск новых, специфических для БАС, маркеров нейродегенеративного процесса в спинномозговой жидкости (СМЖ). Мы определяли активность веществ, модулирующих активность цистеиновых протеаз (калпаина, каспазы и катепсина В) в СМЖ пациентов с БАС. СМЖ пациентов с БАС в отличие от СМЖ пациентов с рассенным склерозом достоверно более выражено ингибирует калпаин и катепсин В, чем СМЖ контрольной группы. Активность ЛДГ и концентрация НСЕ в СМЖ пациентов контрольной группы и пациентов с БАС не отличались. Концентрация тяжелых цепей нейрофиламентов в СМЖ была достоверно выше в группе пациентов с БАС, чем в группе контроля. Альбуминовый индекс был повышен у 50% пациентов с БАС. Представлены данные о связи активности ингибитора катепсина, концентрации тяжелых цепей нейрофиламентов и альбуминового индекса с клинической картиной болезни. Согласно нашим данным, концентрация тяжелых цепей нейрофиламентов является чувствительным маркером нейродегенеративного процесса при БАС. Повышение ингибирующей активности СМЖ в отношении катепсина В и калпаина является специфичным для БАС и может свидетельствовать об определенной роли дисбаланса протеолитических систем в патогенезе данного заболевания.
Ключевые слова: калпаин, катепсин, нейрофиламенты, альбуминовый индекс, боковой амиотрофический склероз, спинномозговая жидкость.
Боковой амиотрофический склероз (БАС) -неуклонно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся избирательным повреждением мотонейронов головного и спинного мозга. Средняя продолжительность жизни пациентов составляет от 3 до 5 лет, а диагноз устанавливается лишь через 8-15 месяцев от начала заболевания [1, 2]. Согласно современным критериям, достоверный диагноз возможен лишь при наличии клинических признаков распространения процесса на нескольких уровнях цереброспинальной оси [3]. Таким образом, заболевание существенно прогрессирует еще до постановки диагноза, что заметно снижает потенциальную эффективность любых терапевтических вмешательств. Этим обусловлен интерес исследователей к поиску новых маркеров, которые позволили бы определять активность патологического процесса на самых ранних этапах. Одним из патогенетических механизмов при БАС является ди-срегуляция протеолитических систем [4]. Есть данные, указывающие на участие цистеиновых
* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5а; e-mail: nata_gul@pisem.net
протеаз в гибели мотонейронов при БАС [5]. Активность протеолитических ферментов в ЦНС при этом заболевании может стать маркером развития патологического процесса.
Существенный вклад в исследование протеолитических ферментов и модуляторов их активности может внести анализ СМЖ. В СМЖ циркулируют вещества, секретируемые клетками центральной нервной системы (ЦНС), и продукты, образовавшиеся в результате их гибели [6, 7]. Параллельный анализ сыворотки и СМЖ может выявить нарушение гематоэнцефалического барьера, что также характеризует один из механизмов патогенеза заболевания. Ранее в СМЖ пациентов с БАС описаны изменения в содержании гормонов [8, 9], факторов роста [10, 11], интерлейки-нов, провоспалительных белков [12, 13], нейрон-специфичных белков [14-17].
Целью нашей работы был поиск новых, специфических для БАС, маркеров нейродегенеративного процесса в СМЖ. Было показано, что дисбаланс протеолитических систем, описанный при БАС, находит свое отражение в СМЖ пациентов. В СМЖ больных БАС по сравнению с контроль-
Таблица 1. Характеристика пациентов
Группа Число пациентов Пол, м/ж (%) Возраст, лет
БАС 34 20/14 (58.8/41.2) 50.7 ± 10.6
РС 10 2/8 (20/80) 36.3 ± 9.15*
Контрольная 21 13/8 (61.9/38.1) 56.7 ± 12.4
группа
*Достоверное отличие от контрольной группы (р < 0.05).
ной группой снижено содержание цистатина С и металлопептидазного ингибитора 1 (TIMP-1), а также повышена калпаиноподобная активность [18-21].
Нашей задачей стало определение способности СМЖ пациентов с БАС модулировать активность цистеиновых протеаз (калпаина, каспазы-3 и катепсина В). Для выявления связи данной активности со степенью выраженности клеточной гибели мы определяли уровень лактатдегидроге-назы (ЛДГ), а также специфических маркеров повреждения нейронов (нейронспецифической ено-лазы (НСЕ), тяжелых цепей нейрофиламентов (НФ-Т) и олигодендроцитов (основной белок миелина (ОБМ)). Альбуминовый индекс определяли для того, чтобы оценить влияние изменений проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) на содержание вышеуказанных маркеров и на выраженность нейродегенеративного процесса.
Для подтверждения специфичности изменений, выявленных в СМЖ пациентов с БАС, нами была набрана группа сравнения - пациенты с рассеянным склерозом (РС).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пациенты. В основную группу были включены 34 больных с достоверным диагнозом БАС. Среди пациентов было 20 мужчин (58.8%) и 14 женщин (41.2%). Возраст больных составил 50.7 ± 10.6 лет (табл. 1). В зависимости от первичного уровня поражения выделено 3 группы больных с различными формами БАС согласно ранее предложенным классификациям. Шейно-грудная форма была отмечена у 17 (50%) больных БАС, пояснично-крестцовая - у 9 (26.5%), бульбарная -у 8 (23.5%).
Все больные были также разделены на подгруппы в зависимости от варианта течения, длительности заболевания и темпа прогрессирования патологического процесса. Смешанный вариант течения заболевания, характеризующийся одинаковой степенью поражения верхнего и нижнего мотонейронов, встречался у 23 больных (67.6%). Преобладание сегментарно-ядерных нарушений ("переднероговой вариант") или пирамидной симптоматики наблюдалось у 8 (23.5%) и 3 (8.8%)
больных соответственно. Длительность заболевания до 1 года отмечена у 12 больных (35.3%), от 1 года до 2 лет - у 11 (32.4%), более 2 лет - у 11 (32.4%). В обследованной группе быстрый темп прогрессирования наблюдался у 22 (64.7%) больных, медленный - у 12 (35.3%) человек.
Первую группу сравнения составили 10 пациентов с PC с ремиттирующим течением. Среди больных PC было 2 мужчин (20%) и 8 женщин (80%). Возраст больных PC составлял 36.3 ± 9.15 лет и был достоверно ниже, чем в контрольной группе. Длительность заболевания составляла от 5 мес. до 17 лет. Тяжесть неврологического дефицита по шкале EDSS колебалась от 1 до 4 баллов.
В контрольную группу был включен 21 больной с острой хирургической патологией, которым проводилась спинномозговая анестезия. Возраст пациентов контрольной группы составил 56.7 ± 12.4 лет.
Пробы спинномозговой жидкости были центрифугированы и хранились при температуре -70°C.
Биохимические методы исследования. Концентрация белка определялась по методу Bradford с использованием БСА в качестве стандарта. Определение активности ЛДГ проводили согласно методическим рекомендациям, приведенным в Lases et al. с модификациями. Концентрацию НСЕ определяли твердофазным иммуноферментным анализом с помощью ELISA NSE Kit (IBL, США). Концентрацию НФ-Т определяли твердофазным иммуноферментным анализом с помощью ELISA NF-H Kit (EnCor, США). Концентрацию ОБМ определяли твердофазным иммуноферментным анализом с помощью ELISA MBP Kit (DSL, США).
Определение влияния СМЖ на активность цистеиновых протеаз проводили флюорометриче-ским способом.
Для определения влияния на активность каспазы-3 СМЖ смешивали с активной рекомбинант-ной человеческой каспазой-3 (BioSource International Inc., США) и реакционной средой, содержащей флюорогенный субстрат каспазы-3 Ac-DEVD-AMC (Biomol, США).
Для определения влияния на активность калпаина СМЖ смешивали с активным очищенным человеческим калпаином-1 (Sigma, США) и реакционной средой, содержащей флюорогенный субстрат калпаина Ac-LY-AMC (Biomol, США).
Для определения влияния на активность катепсина В СМЖ смешивали с активным очищенным бычьим катепсином В (Sigma, США) и реакционной средой, содержащей флюороген-ный субстрат катепсина В Z-RR-AMC (Biomol, США).
Измерение производили в 384-луночной плашке NUNC 384. Влияние ликвора на активность
МОДУЛЯТОРЫ АКТИВНОСТИ ЦИСТЕИНОВЫХ ПРОТЕАЗ 350 г
300 250 200 150 100 50 0
□ Чистый фермент
■ Фермент + СМЖ Контроль (n =10)
□ Фермент + СМЖ БАС (n =17)
" ^ *
*
т
1
Калпаин
Каспаза
Катепсин
Рис. 1. Активность ферментов при добавлении СМЖ пациентов с БАС. * - достоверное отличие от контроля (р < 0.05).
Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего. По оси ординат - активность ферментов в процентах активности чистого фермента.
фермента оценивали в виде среднего от остаточной активности фермента в процентах.
Статистический анализ проводили в программе "Statistica for Windows ver. 7.0". Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение, либо в форме Медиана [нижний квартиль; верхний квартиль]. Для выявления различий между группами использовали тест Манна-Уит-ни. Корреляционный анализ проводили с помощью критерия Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В результате проведенного исследования установлено, что СМЖ пациентов из контрольной группы активирует каспазу-3, ингибирует катепсин В и калпаин 1. При сравнении с контрольной группой СМЖ пациентов с БАС достоверно более выражено ингибирует калпаин 1 и катепсин В (рис. 1). Различий по влиянию на ферменты в группе РС не получено.
У пациентов с БАС выявлен специфический для данного заболевания профиль влияния СМЖ на активность цистеиновых про
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.