УДК 591.112.1
МОДУЛЯЦИЯ ОКСИДОМ АЗОТА ИНТЕНСИВНОСТИ НЕКВАНТОВОЙ СЕКРЕЦИИ АЦЕТИЛХОЛИНА В МИОКАРДЕ ПРАВОГО
ПРЕДСЕРДИЯ КРЫСЫ
© 2012 г. Д. В. Абрамочкин1*, А. А. Бородинова1, Е. Е. Никольский2, 3, Л. В. Розенштраух4
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, *электронная почта: abram340@mail.ru 2Казанский институт биохимии и биофизики РАН, 420111, Казань, ул. Лобачевского, 2/31 3Казанский государственный медицинский университет, 420012, Казань, ул. Бутлерова, 49 4НИИэкспериментальной кардиологии ФГУ "РКНПКРосмедтехнологий", 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., 15а Поступила в редакцию 19.01.2012 г.
Основной медиатор парасимпатической нервной системы ацетилхолин (АХ) выделяется в миокарде из окончаний интрамуральных постганглионарных парасимпатических нейронов. Недавно было показано, что в этих нейронах существует механизм неквантовой секреции АХ, не связанный с эк-зоцитозом везикул, содержащих АХ, в ответ на импульсную активность нейронов. Предполагается, что этот механизм опосредован транспортерами обратного захвата холина. Об интенсивности неквантовой секреции в сердце можно судить по степени выраженности эффектов ингибиторов аце-тилхолинэстеразы, вызывающих накопление в миокарде неквантового АХ. В представленной работе изучено влияние потенциальных регуляторов неквантовой секреции АХ — оксида азота (NO) и ATP — на выраженность холинергических эффектов параоксона, фосфорорганического ингибитора холинэстеразы. Использовался метод внутриклеточной регистрации биоэлектрической активности в препарате изолированного правого предсердия крысы. В норме параоксон (10-7—10-5 М) вызывал выраженное снижение длительности потенциала действия (на уровне 50 и 90% реполяризации) в рабочем миокарде правого предсердия, а также замедление синусового ритма. ATP, подавляющий неквантовую секрецию АХ в нервно-мышечном синапсе, даже в высокой концентрации (10-4 М) не вызывал статистически значимого уменьшения или увеличения эффектов параоксона (5 х 10-6 М). Доноры NO нитропруссид натрия (10-5 М) и SNAP (10-4 М) значимо уменьшали степень укорочения потенциала действия, вызванного параоксоном (5 х 10-6 М). Кроме того, нитропруссид натрия на 43.7% снижал отрицательный хронотропный эффект параоксона. Напротив, ингибитор NO-синтазы L-NAME (10-4 М), подавляющий синтез эндогенного NO, усиливал укорочение потенциала действия, вызванного параоксоном. Можно заключить, что NO способен модулировать интенсивность неквантовой секреции АХ в предсердном миокарде.
Ключевые слова: параоксон, потенциал действия, ацетилхолин, сердце, оксид азота, неквантовая секреция.
Парасимпатическая регуляция сердца чрезвычайно важна для обеспечения его нормальной работы. Принято считать, что она реализуется за счет выброса квантов ацетилхолина (АХ) из окончаний интрамуральных парасимпатических постганглионарных нейронов [1]. Известно, что квантовая секреция АХ связана с возбуждением этих нейронов, в ответ на сигналы, приходящие по аксонам преганглионарных нейронов, находящимся в составе блуждающего нерва. Недавно нами было показано, что в парасимпатических постганглио-нарных нейронах существует принципиально иной, неквантовый способ секреции АХ [2].
Механизмы квантовой и неквантовой секреции медиатора были открыты и подробно изуче-
ны на примере секреции АХ в нервно-мышечном синапсе. Квантовая секреция представляет собой выделение в синаптическую щель мультимолеку-лярных порций медиатора, содержащихся в си-наптических везикулах, в ходе их экзоцитоза. Импульсная активность нейрона запускает выброс множества квантов медиатора. Неквантовая секреция сосуществует с квантовой, однако она не связана с возбуждением нейрона, а представляет собой непрерывное выделение АХ из цитоплазмы нервных окончаний в синаптическую щель. Есть веские основания считать, что роль транспортера АХ выполняет система обратного захвата холина с высоким сродством [3—6]. Электрофизиологическим параметром, характеризующим интен-
сивность неквантовой секреции в нервно-мышечном синапсе, является величина Н-ответа [6]. Н-Эффект ("H" от hyperpolarization) — резкое увеличение мембранного потенциала мышечного волокна, в котором предварительно подавлена активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ), в ответ на аппликацию блокатора никотиновых холино-рецепторов d-тубокурарина. Величина Н-эффек-та пропорциональна интенсивности неквантовой секреции. Об интенсивности неквантовой секреции АХ в сердце можно судить по выраженности эффектов ингибиторов АХЭ, которые вызывают накопление АХ в изолированных препаратах миокарда, не получающих сигналов по блуждающему нерву. Нами показано, что накапливающийся в этом случае АХ имеет неквантовое происхождение [2, 7].
В то время как регуляция процессов квантового высвобождения медиаторов изучена достаточно подробно, о механизмах регуляции неквантовой секреции известно немного. В нервно-мышечном синапсе неквантовая секреция АХ подавляется ATP, комедиатором АХ [6]. Кроме того, глутамат [8] и сам АХ [9] вызывают снижение интенсивности неквантовой секреции, опосредованное оксидом азота (NO), который выделяется мышечными волокнами в ответ на действие глутамата или АХ и диффундирует ретроградно в нервное окончание. Таким образом, ATP и NO входят в число регуляторов неквантовой секреции в нервно-мышечном синапсе. В представленной работе мы изучали влияние этих веществ на выраженность холинергических эффектов параоксона, фосфорорганического ингибитора холинэстеразы, по которому можно судить о действии ATP и NO на интенсивность неквантовой секреции в миокарде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Самцов белых беспородных крыс весом 250— 300 г декапитировали, вскрывали грудную клетку и быстро вырезали сердце, которое промывали физиологическим раствором (состав в мМ: NaCl 130.0; KCl 5.6; NaH2PO4 0.6; MgCl2 1.1; CaCl2 1.8; NaHCO3 20.0 и глюкоза 11.0), насыщенным кар-богеном (95% О2, 5% СО2) с рН 7.4 ± 0.2. Выделяли препарат правого предсердия, включающий ушко, пограничный гребешок, межвенную область и синоатриальный узел. Препарат закрепляли на дне экспериментальной камеры, через которую со скоростью 10 мл/мин протекал физиологический раствор (37.5°С). После 2 ч адаптации препарата к условиям эксперимента начинали регистрацию трансмембранного потенциала с помощью стеклянных микроэлектродов (20—30 МОм), запол-
ненных 3.0 М раствором KCl, соединенных с усилителем для внутриклеточной регистрации. Сигналы оцифровывали и анализировали с использованием специального программного оборудования (L-Card, Россия; Synaptosoft, США). Спонтанные потенциалы действия (ПД) регистрировали в субэндокардиальных волокнах ушка предсердия. При обработке записей определяли изменения в длительности цикла (ДЦ), т.е. интервал между соседними ПД, и длительность ПД на уровне 50% (ДПД50) и 90% реполяризации.
В работе использовали следующие реактивы (Sigma, США): фосфорорганический ингибитор АХЭ параоксон, блокатор мускариновых рецепторов атропин, блокатор системы обратного захвата холина высокого сродства гемихолиний III, натриевую соль ATP, доноры NO — нитропруссид натрия и SNAP (S-nitroso-N-acetylpenicillamine), а также ингибитор NO-синтазы L-NAME (Nffl-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride). Для изучения эффектов параоксона его раствор подавали в экспериментальную камеру в течение 20 мин.
Все результаты в тексте, таблицах и на рисунках представлены как среднее ± ошибка среднего для n экспериментов. Статистическую значимость эффектов различных концентраций пара-оксона по сравнению с контролем выявляли с помощью теста Вилкоксона. Статистическую значимость различий между эффектами параоксона в контроле и на фоне других соединений определяли с помощью критерия Манна—Уитни. Результаты считали статистически значимыми при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе работы оценивали изменения электрической активности препаратов правого предсердия, обусловленные действием параоксо-на. В соответствии с полученными ранее данными, другой фосфорорганический ингибитор АХЭ — армин, а также карбаматный ингибитор неостиг-мин вызывают в миокарде типичные холинерги-ческие эффекты [2]. Параоксон (10-7—10-5 M) вызывал выраженное уменьшение ДПД50 и ДПД90 (рис. 1) и увеличение ДЦ (рис. 1б). Эти эффекты параоксона развивались медленно, достигая уровня плато через 12—13 мин после начала суперфузии. В остальных опытах с параоксоном наблюдали аналогичное развитие эффектов во времени, поэтому в дальнейшем мы обсуждаем только максимальные величины укорочения ПД и удлинения сердечного цикла. Ни в одном из экспериментов не наблюдалось значимых изменений потенциала покоя и амплитуды ПД.
МОДУЛЯЦИЯ ОКСИДОМ АЗОТА ИНТЕНСИВНОСТИ неквантовой секреции
319
40
20
В
4
св
5
Я «
s
о с =s
3 «
«
се ft VO
20
40
60
-80
Параоксон,5 х 10-6 М
20 мс
а
0
1 2 3 4 5 6 7 8 12345678 1 2 3 4 5 6 7 8
Уменьшение ДПД50 Уменьшение ДПД90 Увеличение ДЦ
Рис. 1. Влияние параоксона на электрическую активность рабочего миокарда правого предсердия крысы. а — Оригинальные записи ПД в контроле и во время максимального развития эффектов параоксона (5 х 10—6 M). б — Влияние параоксона в диапазоне концентраций 10-7—10-5 M (1—6) на длительность ПД (ДПД) и длительность цикла (ДЦ), а также параоксона в присутствии атропина (7) или гемихолиния III (8). По оси ординат — уменьшение ДПД или увеличение ДЦ, в %. 1 — Параоксон, 10-7 М (n = 5); 2 — параоксон, 5 х 10-7 М (n = 6); 3 — параоксон, 10—6 М, (n = 8); 4 — параоксон, 2.5 х 10—6 М (n = 5); 5 — параоксон, 5 х 10—6 М (n = 14); 6 — параоксон, 10—5 М (n = 6); 7 — параоксон, 5 х 10—6 М + атропин, 3 х 10—6 М (n = 8); 8 — параоксон, 5 х 10—6 М + гемихолиний, 10—5 М (n = 7). Эффекты параоксона во всех концентрациях, кроме 10—7 M, статистически значимо отличаются от контрольных величин по критерию Вилкоксона. *p < 0.05, критерий Манна—Уитни.
Отметим, что параоксон в концентрации 10—5 M вызывал менее выраженные изменения ДПД и ДЦ, чем в концентрации 5 х 10—6 M. Это отличие
могло быть связано со способностью ингибиторов холинэстеразы частично блокировать муска-риновые холинорецепторы [10].
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.