МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.32
МОЛЕКУЛЯР НАЯ ДИНАМИКА ВЗАИМОДЕЙ СТВИЙ N- И С-КОНЦЕВЫХ ДОМЕНОВ ПРИ АВТОИНГИБИРОВАНИИ И АКТИВАЦИИ ФОР МИНА mDial
© 2015 г. И.А. Оршанский, А.В. Попинако*, А.Д. Коромыслова**, О.И. Волоx***, К.В. Шайтан*** ****, О.^ ^колова***
ЗАО «Байер», 107113, Москва, 3-я Рыбинскаяул., 18/2; *Институт биох имии им. А .Н. Бах а РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 33/2; **Университет Гейдельберга, 69117, Гейдельберг, Грабенгассе, 1, Германия; ***Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1/12; ****Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: sokoloval84@gmail.com Поступила в p едакцию 07.04.15 г.
Методом управляемой молекулярной динамики были определены пары аминокислотных остатков на поверхности взаимодействующих доменов формина mDial: DID-DAD, контролирующих автоингибирование формина и DID с ГТФазой Rho, отвечающих за активацию. Наиболее стабильными являются ионные взаимодействия между остатками Glu178 и Arg248, а также гидрофобные взаимодействия атома углерода Thr175 с ароматическим кольцом Phe247. Взаимодействия DID с Rho оказались наиболее сильными. Они опосредованы специфическими тройными ионными взаимодействиями между положительно заряженными аминокислотами из Rho и триплета аминокислот в составе домена DID, состоящего из двух отрицательно заряженных аминокислот, разделенных одной незаряженной. Сайты связывания домена DID с Rho и DAD частично перекрываются, но во взаимодействиях с различными партнерами принимают уча стие различные аминокислоты DID. Обсуждаются возможные конформационные изменения доменов формина при активации и инактивации.
Ключевые слова: актинсвязывающие белки, формин, молекулярная динамика, DID, DAD, Rho-ГТФаза.
Многие клеточные процессы, такие как перемещение клеток, цитокинез, поддержание поляр ности клетки, везикуляр ный транспорт, морфология и иммунные реакции происходят благодаря работе актинового цитоскелета [1,2]. Ак-тиновые филаменты - это поляр ные структуры, хар актеризующиеся быстрор астущим оперенным концом и медленно растущим заостренным концом. Рост филаментов регулир уется внеклеточными раздражителями, которые активируют сигнальный каскад реакций. К таким сигнальным молекулам относится Rho-ГТФаза (Rho).
В данном исследовании изучали работу ключевого актинсвязывающего белка формина mDial, контролирующего формирование de novo актиновых филаментов. В клетке формин находится в автоингибир ованном состоянии [3,4]. Автоингибирование обусловлено внутримолекулярными взаимодействиями между N-
Сокращения: Rho - Rho-ГТФаза; МД - молекулярная динамика; УМД - управляемая молекулярная динамика.
концевым регулятор ным участком формина: Diaphanous Inhibitory Domain (DID) и его консервативным C-концевым сегментом, называемым Diaphanous Autoregulatory Domain (DAD) [5,6]. Автоингибирование было продемонстрировано в экспериментах по совместной экспрессии изолир ованных N- и C-концевых фрагментов молекулы формина [5,7,8].
Активация формина происходит при связывании Rho-ГТФазы с GBD-доменом формина [5,8,9]. C помощью ЯМР и биохимических экспериментов было выявлено, что области контактов DID-Rho и DID-DAD частично перекрываются, что позволило предположить наличие механизма конкур ентного связывания [7,10]. В результате связывания с Rho формин изменяет свою конформацию и пр остранствен-ное расположение доменов таким образом, что оказывается возможным взаимодействие фор-мина с мономерами актина и формирование полимер ной цепи актина [11]. Ранее Отомо и Роуз с соавторами получили кристаллическую
451
3*
Рис. 1. Молекулярная динамика В1В-ВЛВ-комплек-са в течение 10 не. Расстояния между парами остатков на поверхности взаимодействия В1В-ВЛВ.
структуру изолированного N-терминального участка DID [9], а также его структуру в составе комплекса с Rho [10]. Однако в кристаллической структур е возможно искаженное расположение некоторых поверхностных аминокислот, обусловленное упаковкой белка в кр исталличе-ской решетке. Следовательно, свойства междоменных взаимодействий, опр еделяемые поверхностными аминокислотами, представляют со -бой особый интерес для молекулярного моделирования и проведения численных экспериментов.
Таким образом, пр едметом данного исследования явилось взаимодействие в комплексах DID-DAD и DID-Rho и роль специфических аминокислот на взаимодействующих поверхностях. Методом молекулярной динамики (МД) исследована роль отдельных аминокислотных остатков в составе доменов фор мина: DID и DAD, уча ствующих в образовании стабильных комплексов при автоингибировании и активации формина с помощью Rho-ГТФазы. Была проведена оценка стабильности комплексов, выделены предполагаемые типы взаимодействий.
МЕТОДЫ
Объекты исследования. К ристаллическая структура комплекса DID-Rho мыши ^db ode: 1Z2C), кристаллическая структура комплекса DID-DAD мыши ^db ode: 1F31).
Молекулярная динамика. Параметры метода. Для расчетов использовали программный пакет Огашас8 3.3, силовое поле OPLS-AA/L.
Расчетная длина траектории 10 нс (1 нс для р елаксации), шаг интегрир ования - 1 фс. Р ас-четы проводили в периодической ячейке при использовании стохастической динамики в качестве термостата (поддерживаемая температура 300 К). Алгоритм расчета - Leapfrog.
Релаксация. Источником начальных структур являлись молекулярные структуры, полученные методом кристаллографии ^db ode: 1F31 для структуры комплекса DID-DAD и 1Z2C для структуры комплекса DID-Rho ). И сходная структура изначально релаксировалась. К отрелаксированной структуре пр именяли управляемую молекулярную динамику (УМД).
Управляемая молекулярная динамика. Данный метод применяли для оценки прочности взаимодействия между доменами, а также определения ключевых точек для взаимодействия.
В пр отоколе УМД центр масс домена DID фиксировали, а к центру домена масс DAD или Rho пр именяли силу, направленную по нор мали к плоскости контакта доменов. Сила была постоянной в каждом эксперименте. Между сериями экспериментов сила увеличивалась
о
с шагом 70 ккал/(моль-А).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Взаимодействия в комплексе DID-DAD. На
первом этапе проводили МД в течение 1 нс для релаксации кристаллической структуры мышиного комплекса DID-DAD, полученной из базы данных белковых структур Protein Data Bank ^db ode 1F31). После релаксации анализировали образование устойчивых ионных и гидрофобных взаимодействий между отдельными аминокислотами. Было выделено четыре пары аминокислотных остатков, взаимодействие между которыми стабилизировало комплекс DID-DAD: A117DID-F247DAD; A117DID-L237DAD; E178did-R248Dad; T175DID-F247DAD. Данные аминокислотные остатки находились друг от друга на расстоянии менее 1 нм.
С помощью метода МД проводили численный эксперимент, затем на основании полученной траектории оценивали изменение р асстоя-ния между аминокислотными остатками (рис. 1). Согласно полученным данным наиболее сильные взаимодействия наблюдали между
E178did и R248dad, A117did и F247dad.
T175
DID
и F247
При этом E178
DAD
DID
и
R248dad образуют ионную связь, а A117
DID
Р247ВЛВ и Т175В1В-Р247ВЛВ определены гидрофобными взаимодействиями.
Для исследования роли отдельных аминокислот в стабилизации В1В-ВЛВ поверхности
мы пр именили УМД. Центр масс домена DID фиксировали, и к центру масс домена DAD прилагали различные силы. Приложение сил
о
величиной 1-70 ккал/(моль-А) показало отсутствие существенного увеличения расстояния между центрами масс DID- и Rho-доменов (данные не представлены). Критическое значение приложенной силы было достигнуто уже при 80 ккал/(мольЕ): комплекс DID-DAD полностью диссоциировал после 1,3 нс УМД (рис. 2). Были выделены аминокислоты, уча ствующие в междоменном взаимодействии пр и значительных конформационных изменениях DAD-доме-на E178d!d-R248dad, T175did-F247dad.
Взаимодействия в комоле^е DID-Rho. П ри исследовании кристаллической структуры комплекса DID-Rho из mDia1 (рёЪ ode 1Z2C) [10] были показаны следующие пары взаимодействующих аминокислот: Y66Rho-K108GBD; Q63Rho-
K 108gbd ; V38Rho-P 103gbd ; E40Rho-K107GBD;
D67Rho-N164DID; D67Rho-N165DID. C применением метода МД было показано, что наиболее стабильные взаимодействия формируются между следующими парами о статков: D67Rho-
N164d!d, E40Rho-K107GBD, V38Rho-P103GBD
(рис. 3). Следовательно, основу формирования DID-Rho-комплексов составляют гидрофобные и ионные взаимодействия.
Метод УМД применяли для исследования взаимодействий между специфическими аминокислотными остатками, стабилизирующими комплекс по принципу «молекулярных замков». П р и этом фиксировали центр масс DID-домена и силы различной величины прикладывали к центру масс Rho. Взаимодействие между доменом DID и ГТФазой Rho оказалось значительно сильнее, чем между доменами DID и DAD.
о
Приложение сил от 1 до 399 ккал/(моль-А) не показало существенного увеличения расстояния между центрами масс домена DID и Rho (данные не пр едставлены). П риложение силы 400-
о
500 ккал/(моль-А) позволило определить два ключевых участка, где взаимодействия были наиболее сильными. В каждом из них были впервые отмечены тройные ионные взаимодействия.
Пер вый ключевой участок образован в результате взаимодействия положительно заряженного K133Rho и отрицательно заряженных E427did и E429d¡d. Во втором ключевом участке ионное взаимодействие формируют положительно заряженный R68Rho и отрицательно заряженные N253DID и N255DID (рис. 4).
Данные тройные комплексы, согласно данным УМД, являются наиболее стабильными и взаимодействуют на протяжении достаточно
6
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Время, пс
Ртс. 2. Расстояние между DID-DAD-доменами при
приложении силы 80 ккал/(моль-А).
долгого времени, после того как все остальные взаимодействия диссоциируют (рис. 5).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
С пецифическое взаимодействие N-концево-го домена формина DID с его С-концевым доменом DAD пр и автоингибир овании считается широко известным фактом, однако механизм взаимодействия является предметом дискуссий. Ламмерс с коллегами [7] пр едположили, что амино
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.