МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 6, с. 768-776
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.282.232:579.26:575.113
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИВЕРГЕНЦИЯ ПОЧВЕННЫХ ДРОЖЖЕЙ
WILLIOPSIS SENSU STRICTO
© 2004 г. Е. С. Наумова1, Д. О. Газдиев1'23, Г. И. Наумов1*
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва 2Ботанический сад Амурского научного центра ДВО РАН, Благовещенск 3Амурский комплексный научно-исследовательский институт Амурского научного центра ДВО РАН,
Благовещенск Поступила в редакцию 16.03.04 г.
Методом рестриктазного анализа амплифицированного фрагмента рДНК, включающего ген 5.8S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры (ITS1 и ITS2), изучено 53 штамма дрожжей с са-турновидными спорами. С помощью эндонуклеаз HaeIII и MspI можно четко дифференцировать дрожжи Williopsis mucosa, W. salicorniae, Zygowilliopsis californica, Komagataea pratensis и комплекс Willipsis sensu stricto. Предложено использование минисателлитного праймера М13 для разделения видов-двойников Williopsis sensu stricto, имеющих идентичные рестриктазные профили. Использование ПЦР с праймером М13 позволило провести реидентификацию ряда музейных штаммов, определить видовую принадлежность выделенных нами на Дальнем Востоке дрожжей с сатурновидными спорами, а также обнаружить три штамма, представляющих собой новые таксоны. Последние штаммы имеют уникальные ПЦР-профили и отличаются по нуклеотидным последовательностям участков ITS1 и ITS2 рДНК. Обсуждается возможное несоответствие результатов, полученных с помощью различных молекулярных методов.
Ключевые слова: Williopsis sensu stricto, Zygowilliopsis, Komagataea, ПДРФ-анализ, ITS1 и ITS2 рДНК.
Прогресс в области молекулярной биологии привел к появлению новых методов, которые начинают широко использоваться в систематике дрожжей, наряду с традиционными морфолого-физиологическими тестами. Для разделения таксонов дрожжей и установления их филогенетического родства применяется анализ последовательностей генов рибосомной РНК, позволяющий оценивать родство дрожжей как на видовом, так и на родовом уровнях. Разные районы рДНК имеют неодинаковое филогенетическое значение. Обычно анализируют последовательности генов 18S и 26S рРНК, а также внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 [1]. Kurtzman и Robnett [2] провели секвенирование вариабельного участка D1/D2 26S рДНК длиной в 600 нук-леотидов у большинства известных видов аскоми-цетовых дрожжей. Это исследование позволило создать компьютерную базу данных для таксономического определения дрожжей. Секвенирование генов рРНК является достаточно дорогостоящей и трудоемкой процедурой и, в основном, проводится для характеристики типовых культур или ограниченного количества штамов. В случае большого количества штаммов более применим рест-
риктазный анализ амплифицированных фрагмен-
*
Адресат для корреспонденции (e-mail: gnaumov@yahoo.com).
тов рДНК, включающих как ген 18S рРНК [3], так и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 [4].
Дрожжи, образующие сатурновидные споры, имеются в составе разных родов: Williopsis, Sac-charomycopsis, Pichia и Saturnispora [5]. Видовой состав этих родов часто пересматривается в результате появления новых критериев, оценивающих филогенетическое родство. Род Williopsis Zend-er, принятый в последнем определителе дрожжей [5], включает пять видов: Williopsis californica, W. mucosa, W. pratensis, W. salicorniae и W. saturnus с пятью разновидностями: var. saturnus, var. mrakii, var. sargentensis, var. suaveolens, var. subsufficiens. В то же время молекулярные и генетические данные свидетельствуют о большой гетерогенности рода Williopsis sensu Kurtzman 1998. Сравнение последовательностей генов 18S и 26S рРНК выявило значительную дивергенцию видов W. californica, W. mucosa, W. pratensis, W. salicorniae и W. saturnus [6-9], каждый из которых очевидно представляет собой отдельный род. На основании значительных отличий последовательностей рДНК и мор-фолого-физиологических особенностей Yamada с соавт. [7] создали новый род Komagataeae с видом K. pratensis и предложили восстановить род Zygowilliopsis Kudriavzev с видом Z. californica. Необходимость восстановления последнего рода была
ранее обоснована гибридологическим анализом [10, 11]. Неоднозначной является и классификация дрожжей комплекса W. saturnus (Williopsis sensu stricto), которые в последнем определителе дрожжей рассматриваются как разновидности, а W. beijerinckii отнесен к синонимам W. saturnus var. saturnus [5]. Данные генетического гибридологического анализа свидетельствуют о видовом статусе дрожжей W. saturnus, W. beijerinckii, W. mrakii, W. suaveolens и W. subsufficiens [11-15]. Согласно ДНК-ДНК-реассоциации в этот комплекс входят и дрожжи W. sargentensis [11, 16, 17]. Шесть приведенных видов-двойников имеют 36-78% ДНК-ДНК-реассоциации, идентичные последовательности генов 18S и 26S рРНК и могут быть дифференцированы по последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 [7, 9, 16, 17].
В данной работе на основе рестриктазного анализа амплифицированного фрагмента ядерной рибосомной ДНК, включающего ген 5.8S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 (5.8S-ITS-фрагмент), проведено сравнительное изучение коллекционных штаммов родов Williopsis, Zygowilliopsis и Komagataeae, а также выделенных нами дрожжей с сатурновидными спорами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали 50 музейных штаммов, включая типовые культуры Williopsis saturnus CBS 254, W. suaveolens CBS 255, W. beijerinckii CBS 2564, W. mrakii CBS 1707, W. subsufficiens CBS 5763, W. sargentensis CBS 6342, Zygowilliopsis cali-fornica CBS 252, W. mucosa CBS 6341, W. salicorniae CBS 8071 и Komagataea pratensis CBS 7079. Большинство штаммов выделены из почв в различных регионах мира (таблица). Три штамма (01.02, 09.02, 48.02) изолированы нами из пойменных ал-лювиально-луговых почв на юге Дальнего Востока России в 2002 г. Образцы отбирали из разрезов с глубины 0-15 см. Посев проводили на полную питательную среду YPD (г/л): глюкоза - 20, пептона - 10, дрожжевой экстракт - 5, агар - 20. Все типы колоний микроскопировали, а определение дрожжей проводили стандартными методами по определителю [5]. Дрожжи культивировали при 28°C на полной питательной среде YPD. Спорообразование индуцировали при 28°C на голодной среде (г/л): мальтоза - 30, агар - 20.
ПЦР-анализ. Выделение ДНК проводили, как описано ранее [18]. Полимеразную цепную реакцию осуществляли на ДНК-амплификаторе "Тер-цик" ("ДНК-Технология", Россия). 5^-Ш-фраг-мент рДНК амплифицировали с помощью прай-меров pITS1 (5 '-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') и pITS4 (5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3') [19]. ПЦР проводили в 30 мкл реакционной смеси, со-
держащей ПЦР-буфер 20 мМ (NH4)2SO4, 3 мМ MgCl2, 0.25 мМ dNTP, 0.30 мкМ каждого прайме-ра, 1.25 ед. Taq-полимеразы ("Синтол", Россия) и 20-200 нг анализируемой геномной ДНК в следующем режиме. Начальная денатурация - 94°C в течение 3 мин; следующие 30 циклов в режиме: денатурация ДНК - 94°C, 2 мин; отжиг праймеров -60°C, 1 мин; синтез ДНК - 72°C, 2.5 мин; на последнем цикле - 72°C, 10 мин. ПЦР с праймером М13 (5'-GAGGGTGGCGGTTCT) проводили в 30 мкл реакционной смеси, содержащей ПЦР-буфер 20 мМ (NH4)2SO4, 3 мМ, MgCl2, 0.25 мМ dNTP, 0.30 мкМ каждого праймера, 1.25 ед. Taq-полиме-разы ("Синтол", Россия) и 20-200 нг анализируемой геномной ДНК. Режим ПЦР (35 циклов): денатурация ДНК - 94°C, 45 с; отжиг праймеров -52°C, 30 с; синтез ДНК - 72°C, 2 мин. Продукты амплификации подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле при 60-65 В в 0.5х TBE (45 мМ трис, 10 мМ ЭДТА, 45 мМ борная кислота) в течение 2 ч и окрашивали бромистым этидием. Анализ полиморфизма длин рестриктазных фрагментов (ПДРФ) осуществляли с помощью эндонуклеаз HaeIII, HinfI, MboI и MspI ("Fermentas", Литва). Разделение фрагментов рестрикции проводили в 1.6%-ном агарозном геле при 60-65 В в 0.5х TBE в течение 3 ч. Гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Vilber Lourmat (Франция).
Клонирование. ПЦР-продукты элюировали из геля при помощи набора GeneClean Kit, согласно протоколу фирмы-изготовителя (Bio 101 Inc., США) и затем встраивали по тупым концам в вектор pTZ57R/T, линеаризованный по сайту Eco321 (изошизомер EcoRV). Компетентные клетки E. coli штамма TG1 трансформировали с использованием набора InsT/Aclone™ PCR Product Cloning Kit согласно протоколу фирмы-изготовителя (MBI "Fermentas", Литва). Трансформанты со вставкой отбирали на среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампицилина, субстрат X-gal и индуктор IPTG.
Секвенирование. Нуклеотидные последовательности по двум цепям определяли с помощью секве-нирования по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI 373 A ("Applied Biosystems"). Определенные нуклеотидные последовательности заложены в Генбанк под следующими номерами (Accession numbers): AY563508 (CBS 254), AY563509 (CBS 2564), AY563510 (CBS 2876), AY563511 (CBS 1669), AY56512 (CBS 6291) и AY563513 (IFO 1776).
Филогенетический анализ. Поиск гомологии с известными нуклеотидными последовательностями проводили в программе BLAST. Множественное выравнивание полученных и уже известных нуклеотдиных последовательностей осуществляли с использованием программы CLUSTAL W.
Используемые в работе штаммы родов Williopsis, Zygowilliopsis и Komagataea
Исходное видовое название № штамма Субстрат и место выделения Установленная видовая принадлежность
W. saturnus CBS 254 (T) Почва, Гималаи W. saturnus
CBS 5761 США »
CBS 112 Неизвестно »
CBS 6291 Почва, Нигерия Williopsis sp. N1
IFO 0811 Почва, Япония W. saturnus
IFO 0993 » »
IFO 1772 » »
IFO 1773 Полуразложившаяся подстилка, Япония »
IFO 1774 » »
IFO 1775 Почва, Япония »
IFO 1776 » Williopsis sp. N2
CCY 81-2-1 Почва из под мхов, Man Pocton, Северная Корея W. saturnus
CCY 81-2-2 Почва из под мхов, Pionsan, Северная Корея »
W. beijerinckii CBS 2564 (T) Почва, Южная Африка W. beijerinckii
CBS 2876 » »
CBS 4549 Помет слона, Япония »
CBS 4304
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.