ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2013, том 60, № 4, с. 569-573
УДК 581.1:582.263:593.4 (268.46)
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ ЗЕЛЕНОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ, ИЗОЛИРОВАННОЙ ИЗ ГУБКИ Halichondria panicea (Pallas, 1766)
БЕЛОГО МОРЯ
© 2013 г. Т. Р. Кравцова*, И. В. Лазебная**, О. Е. Лазебный***, Е. Ю. Волкова*, Т. А. Федоренко*, О. А. Горелова*, О. И. Баулина*, Е. С. Лобакова*, А. Е. Васетенков****,
О. А. Кокшарова*****
* Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва **Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва ***Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва ****Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова, Москва ***** Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 01.11.2012 г.
Проведена молекулярная идентификация и филогенетический анализ эукариотической микроводоросли 1Hp86E-2, изолированной из губки Halichondria panicea (Pallas, 1766), обитающей в Белом море, с использованием нуклеотидной последовательности гена 18S рРНК (Генбанк, номер JX437624). Исследования позволили отнести изолят 1Hp86E-2 к роду Desmodesmus. Микроводоросль 1Hp86E-2 показала наибольшее родство с водорослями - Desmodesmus sp. 3Dp86E-1, Desmodesmus sp. 2C166E и Desmodesmus sp. 1Pm66B, изолированными из беспозвоночных животных Белого моря. Филогенетический анализ показал, что это близкородственные организмы, представители монофилетической группы.
Ключевые слова: зеленые микроводоросли Везтойевтш яр. — 188рРНК — 1Т8-1-5,8-1Т8-2 — симбиоз — филогенетический анализ
DOI: 10.7868/S0015330313040064
ВВЕДЕНИЕ
Зеленые одноклеточные микроводоросли, как известно, широко распространены в различных экосистемах [1-4]. Эти микроорганизмы формируют ассоциации с беспозвоночными животными разных таксономических групп [1, 5-11]. Следует отметить, что свободноживущие микроводоросли рода Desmodesmus не были обнаружены в водных образцах Белого моря, но они были успешно изолированы из беломорских ассоциаций с беспозвоночными животными [11]. Известно, что представители отдела СЫогорИ^а сем. 8сепеёе8тасеае родов Scenedesmus и Desmodesmus
Адрес для корреспонденции: Кокшарова Ольга Алексеевна. 119992 Москва, ГСП-1, Воробьевы горы, 1, стр. 40. Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Электронная почта: оа-кокБИагоуа@гатЫег.ги
широко распространены в пресноводных экосистемах. Фенотипическая пластичность в сочетании с постоянно изменяющимися названиями видов сем. Scenedesmaceae в современной таксономии весьма затрудняют идентификацию природных изолятов с помощью только световой и электронной микроскопии [12]. Методы молеку-лярно-генетического типирования и дальнейший филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов, выбранных в качестве молекулярных маркеров, позволяют более точно определить таксономическое положение природных изолятов.
Ранее с помощью методов световой и электронной микроскопии были исследованы микроводоросли 1Hp86E-2 и 3Dp86E-1, изолированные из губки Halichondria panacea (Pallas, 1766) и из гидроида Dynamena pumila (L., 1758) соответственно. Эти водоросли оказались сходны по сво-
ей морфологии, ультраструктуре и составу пигментов и были отнесены по ультраструктурным признакам и по анализу последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS-1-5,8-ITS-2 к роду Desmodesmus [11, 13].
Целью данной работы была молекулярная идентификация и филогенетический анализ эу-кариотической микроводоросли 1Hp86E-2, изолированной из ассоциации с губкой Halichondria panicea, обитающей в Белом море, с использованием нуклеотидной последовательности гена 18S рРНК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования была зеленая микроводоросль 1Hp86E-2, изолированная из губки Halichondria panicea, обитающей в литоральных и сублиторальных зонах Ругозерской губы Кандалакшского залива Белого моря. Процедура выделения и культивирования микроводорослей, изолированных из беспозвоночных животных Белого моря, была описана ранее [14].
Выделение хромосомной ДНК из микроводоросли 1Hp86E-2 проведено по описанному ранее методу [15]. Для амплификации 0.8 т.п.н. фрагмента нуклеотидной последовательности гена 18S pPHK культуры 1Hp86E-2 использовали праймеры 18S-F AACCTGGTTGATCCTGC-CAGT; 18S-R TGATCCTTCTGCAGGTTCAC-CTACG [16]. Ампликоны клонировали в векторе pJET 1.2/blunt с помощью набора для клонирования ПЦР фрагментов CloneJetTM PCR Cloning Kit # K1231 фирмы "Fermentas" (EU). Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer фирмы "Applied Biosystems" в ЦКП "Геном". Нуклеотидная последовательность гена 18S рРНК депонирована в международную базу данных Генбанка под номером JX437624. Фрагменты нуклеотидных последовательностей ITS-1-5,8-ITS-2 рибосомаль-ного кластера микроводорослей 1Hp86E-2 и 3Dp86E-1 взяты из Генбанка (номера JQ313133.1 и JQ313132.1, соответственно). Последовательности из базы данных Генбанка, обладающие 8899% сходством с анализируемыми последовательностями (BLAST NCBI), выравнивали в программе MEGA 5.0 (CLUSTAL_W). Для филогенетических построений использовали алгоритм NJ с бутстреп-поддержкой 1000 итераций (MEGA 5.0). Для последовательности JX437624.1 и гомологичных ей последовательностей применяли эволюционную модель K2+G (MEGA 5.0), наилучшим образом описывающую их изменчивость. Для группы последовательностей, выровненных с
JQ313132.1 и JQ313133.1, применяли алгоритм NJ на основе матрицы ^-расстояний (MEGA 5.0).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В работе проведено клонирование и секвени-рование части гена (791 п.н), кодирующего 18S рРНК в клетках микроводоросли 1Hp86E-2 (Ген-банк, номер JX437624). На рис. 1 представлено филогенетическое древо, построенное на основе сравнения последовательностей гена 18S рРНК изолята 1Hp86E-2 и других водорослей, относящихся к порядку Chlorophyta. Как видно, 1Hp86E-2 является близким родственником Scene-desmus subspicatus (score = 999 bit, ident. = 99%), Desmodesmus pannonicus (score = 978 bit, ident. = 99%), Scenedesmaceae sp. Tow 9/21 P-14w (score = 1184 bit, ident. = 94%). Все культуры формируют кластеры со значениями бутстреп-поддержки не ниже 50%. Полученные данные позволяют утверждать, что культура 1Hp86E-2 относится к сем. Scenedes-maceae.
Для дополнительной идентификации и определения более точного таксономического положения микроводоросли 1Hp86E-2 проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей внутреннего транскрибируемого спейсера ITS-1-5,8-ITS-2 рибосомального кластера 18S pPHK. На рис. 2 представлено филогенетическое дерево, построенное на основе сравнения последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS-1-5,8-ITS-2 штамма Desmodesmus sp. 1Hp86E-2 (506 п.н.) (Генбанк, номер JQ313133) с другими штаммами из рода Desmodesmus. Водоросли Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 и Desmodesmus sp. 1Hp86E-2 кластеризуются с высоким уровнем бутстреп-поддержки с Desmodesmus sp. 1Pm66B и Desmodesmus sp. 2C166E, изолированными из беспозвоночных животных Белого моря. Как видно из филогенетического древа, штаммы Desmodesmus sp. 1Hp86E-2 и Desmodesmus sp. 3Dp86E-1 являются близкими родственниками Desmodesmus sp. FG (score = 886; ident. = 99%), Desmodesmus sp. M1-20 (score = 886; ident. = 99%) [17], обитателями Южной Америки, а также D. multivariabilis, D. komarekii, D. armatus [18], обитателями пресноводных бассейнов другого континента — Северной Америки. Штамм D. multivariabilis var. turskensis выделен из озера Мэри Итаского парка и имеет следующие параметры сходства с Desmodesmus sp. 1Hp86E-2 (score = 767; ident. = 94%).
ОБСУЖДЕНИЕ
Морфологическая пластичность водорослей в пределах сем. Scenedesmaceae вызывает значительные трудности при определении таксономического положения их представителей [12]. В
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ ЗЕЛЕНОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ
571
60
64
69
88
64
74
Desmodesmus sp. 1Hp86E-2 JX437624 Scenedesmus subspicatus AJ249514 Desmodesmuspannonicus FR865711
Uncultured Chlorophyta clone Alchichica AQ2b 5E 10 JN825661
71 I- Scenedesmaceae sp. Tow 9/21 P-14w AY197639
Desmodesmus intermedius FR865703 Desmodesmus subspicatus strain H HQ834485 Scenedesmus armatus var. subalternans FR865727 S. abundans X73995 Chlorella pyrenoidosa AJ242762 — S. communisX73994
Coccoidgreen alga JL 4-10 AY195982 Scenedesmaceae sp. MLO-4 AY197627 S. costato-granulatus X91265 Coccoid scenedesmid sp. Tow 9/21 P-13w AY197638 -Hylodesmus singaporensis strain CAUP H 8001 FJ436342
90
Coelastrum reticulatum strain SAG AF388382S1
— Scenedesmus vacuolatus X56104
-Enallax acutiformis AB037089
671-Dimorphococcus lunatus AF388379
I Scenedesmus regularis AB037095 Tetradesmus wisconsinensis AB037097
86 i Pectinodesmuspectinatus AB037092 I-Scenedesmus obliquus A J249515
651 Scenedesmus sp. NJ-1 JX286515 "I Scenedesmus sp. II22 FJ946899 Pseudodidymocystis planctonica AB037087 Coelastrella saipanensis AB055800
-Scenedesmus sp. KGU-D002 AB743827
Scotiellopsis terrestris AB012847
Coelastrella multistriata var. corcontica AB037082
77
67
88
61
Coelastrella sp. KGU-H001 AB742452
-Scenedesmus sp. CCMP 1625 AF339735
9 Coelastrella multistriata AB012846 * Graesiella emersonii FR865674 85| Pseudomuriella aurantiaca X91268
I- Pseudomuriella cubensis strain KF2 HQ292770
-Bracteacoccus cinnabarinus strain UTEX 56 HQ902933
-Bracteacoccus sp. BC2-1 AF516676
100
86
Monoraphidium contortum strain AS-11AY846375
-Ankistrodesmus fusiformis X97352
Micractinium sp. CCAP 211/92 FM205863 Actinastrum hantzschii FM205883 Chlorella pyrenoidosa AB240151 Stichococcus sp. FACHB753 EU045358 Stichococcus bacillaris AB0
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.