МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, том 42, № 4, с. 566-570
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА
УДК 577.21;579.23"315
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРОФИЛЬ ЭКСПРЕССИИ НОВОГО ГЕНА, ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩЕГОСЯ В МЫШЦАХ И В СПИННОЙ ЖИРОВОЙ ТКАНИ СВИНЕЙ КИТАЙСКОЙ ПОРОДЫ МЕЙШАН И РОССИЙСКОЙ ПОРОДЫ КРУПНАЯ БЕЛАЯ
© 2008 г. G. Y. Liu1*, Y. Z. Xiong2
1Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed of Yunnan Province, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China 2Key Laboratory of Swine Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture, Huazhong Agricultural University, Wuhan
430070, China Поступила в редакцию 28.06.2007 г.
Принята к печати 29.11.2007 г.
Методом дифференциального дисплея мРНК изучены различия в экспрессии генов в длиннейшей мышце спины и в спинной жировой ткани свиней китайской породы Мейшан и российской породы Крупная Белая. С помощью полуколичественной ОТ-ПЦР идентифицирован новый дифференциально экспрес-сирующийся ген. кДНК этого гена получена методом быстрой амплификации концов кДНК (RACE). Нуклеотидная последовательность этой кДНК не имеет гомологии с последовательностями известных генов свиньи. Согласно предсказанной аминокислотной последовательности, открытая рамка считывания гена кодирует белок из 402 аминокислотных остатков, предположительно содержащий консервативный транспозазный домен DDE. С помощью программы BLAST показано, что белок имеет 100% гомологии с транспозазой Tn10 Oryza sativa, Serratia marcescens и Salmonella. Таким образом, выделенный ген свиньи можно рассматривать как ген транспозазы Tn10 (идентификатор в базе данных 100049649). Профиль экспрессии гена изучили методом ОТ-ПЦР на матрице кДНК из разных тканей одной свиньи породы Мейшан. Умеренная экспрессия гена выявлена в подкожной жировой клетчатке, слабая - в тонком кишечнике, печени, почках и селезенке, в сердце, яичниках, мышцах и легких ген практически не экс-прессируется. Полученные результаты создают основу для изучения гена транспозазы Tn10 свиньи.
Ключевые слова: свинья, дифференциальный дисплей мРНК, RACE, транспозаза Tn10.
MOLECULAR CHARACTERIZATION AND EXPRESSION PROFILE OF A NOVEL PORCINE GENE DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN THE MUSCLE AND BACKFAT TISSUES FROM CHINESE MEISHAN AND RUSSIAN LARGE WHITE PIGS, by G. Y. Liu1, Y. Z. Xiong2 (1Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed of Yunnan Province, Yunnan Agricultural University, Kunming, 650201 China; *e-mail: liuyg4567@163.com; 2Key Laboratory of Swine Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture, Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070 China). The mRNA differential display technique was performed to investigate the differences of gene expression in the longissimus dorsi muscle and backfat tissues from Chinese Meishan and Russian Large White pigs. One novel gene that was differentially expressed was identified through semi-quantitative RT-PCR and the cDNA complete sequence was then obtained using the rapid amplification of cDNA ends (RACE) method. The cDNA sequence of this gene is not homologous to any of the known porcine genes. The sequence prediction analysis revealed that the open reading frame of this gene encodes a protein of 402 amino acids that contains the putative conserved transposase DDE domain and further Blast analysis revealed that this protein has 100% homology with the Tn10 transposase from Oryza sativa, Serratia marcescens, and Salmonella, and therefore, this gene can be defined as the swine Tn10 transposase gene. This novel porcine gene was finally assigned to Gene ID: 100049649. The RT-PCR analysis of the tissue expression profile was carried out using the tissue cDNAs of one Meishan pig as the templates, and the result indicated that this novel swine gene is moderately expressed in fat, and weakly expressed in small intestine, liver, kidney, and spleen but almost not expressed in heart, ovary, muscle, and lung. Our experiment established the primary foundation for further research into the biological significance of swine Tn10 transposase gene.
Key words: pig; mRNA differential display; RACE; Tn10 transposase.
Принятые сокращения: ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией.
* Эл. почта: liuyg4567@163.com
Многие китайские породы свиней, в том числе Мейшан, характеризуются низким содержанием постного мяса, высокой жировой продуктивностью, хорошей устойчивостью к болезням, плодовитостью, высоким качеством мяса, большой продолжительностью жизни и адаптацией к суровым климатическим условиям. Российские породы свиней, например Крупная Белая, обладают такими качествами, как высокая скорость роста, большая доля постного мяса и низкая доля жира, но качество мяса у них хуже, чем у китайских [1, 2].
Метод дифференциального дисплея мРНК [3], позволяет быстро и эффективно выделять и изучать гены с разными уровнями экспрессии в разных тканях. Статистический анализ показал, что для изучения полной популяции транскриптов в клетке достаточно 80-120 комбинаций праймеров [4]. Метод дифференциального дисплея мРНК обладает несколькими преимуществами: в основе его лежат простые и хорошо отработанные процедуры; одновременно можно сравнивать более двух образцов, а количество материала, необходимое для этого, достаточно мало [5].
Фенотипическая вариабельность определяется в основном различиями в экспрессии генов. Мы использовали метод дифференциального дисплея мРНК для выделения генов, экспрессия которых различается в длиннейшей мышце спины и в спинной жировой ткани у свиней китайской породы Мейшан и российской породы Крупная Белая. Такие данные создали бы основу для идентификации генов, определяющих различия между местными китайскими и российскими породами свиней.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение образцов. Чистокровные свиньи китайской породы Мейшан и российской породы Крупная Белая получены в декабре 2002 г. Образцы длиннейшей мышцы спины и спинной жировой ткани взяты у животных, забитых в возрасте 120 дней в марте 2003 г. Суммарную РНК тканей пяти самцов и пяти самок каждой породы выделяли с помощью набора Total RNA Extraction Kit ("Gibco") и объединяли. Перед синтезом первой цепи кДНК РНК обрабатывали ДНКазой I.
Дифференциальный дисплей. Процедуры дифференциального дисплея мРНК и окрашивания серебром проводили, как описано ранее [6, 7].
Полуколичественную ОТ-ПЦР проводили согласно [8-10]. Каждую реакцию ОТ-ПЦР повторяли 5 раз. В качестве внутреннего контроля использовали ген "домашнего хозяйства", кодирующий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (G3PDH). Праймеры к контрольному гену: 5'-ACCACAGTC-CATGCCATCAC-3' (праймер G3PDH 5') и 5'-TC-CACCACCCTGTTGCTGTA-3' (праймер G3PDH 3'). Появление ложно-положительных фрагментов в результате амплификации псевдогенов при загрязне-
нии геномной ДНК контролировали, используя праймеры, специфичные к разным экзонам гена G3PDH. Комбинации праймеров проверяли на геномной ДНК свиньи в качестве отрицательного контроля. При загрязнении кДНК геномной ДНК ам-плифицировался фрагмент размером 780 п. н. При идентификации гена и анализе профиля его экспрессии в различных тканях с помощью ОТ-ПЦР использовали следующие EST- и геноспецифичные праймеры (ген 102): 5'-GGTTGCAGCCACGAGTAAG-3' (прямой праймер) и 5'-GTCACCACCCGTCACCTAA-3' (обратный праймер). Число циклов ПЦР оптимизировали с тем, чтобы интенсивность полосы продукта соответствовала линейной фазе амплификации. Реакционная смесь для ОТ-ПЦР (25 мкл) содержала 2.0 мкл (50 нг) кДНК длиннейшей мышцы спины или спинной жировой ткани, 2.5 мкл смеси dNTP (2 мМ), 2.5 мкл 10-кратного буфера для Taq-ДНК-полимеразы, 2.5 мкл 25 мМ MgCl2, 2.0 мкл 10 мкМ праймера 1 (праймер G3PDH 5' или прямой праймер для гена 102), 2.0 мкл 10 мкМ праймера 2 (праймер G3PDH 3' или обратный праймер для гена 102), 2.0 ед. активности Taq-ДНК-поли-меразы (1 ед./мкл) и 9.5 мкл стерильной воды. Условия амплификации: 4 мин при 94°С; 25 циклов (50 с при 94°С, 50 с при 60°С, 1 мин при 72°С) и заключительный синтез в течение 10 мин при 72°С.
Быстрая амплификация концов кДНК (5'- и 3'-RACE). Реакции 5'- и 3'-RACE проводили согласно инструкции к набору BD SMART RaCe cDNA Amplification Kit ("BD Biosciences"). Использовали ге-носпецифичные праймеры (GSP) 5'-GGGTGGT-GACAATGAGTCCGTGTCG-3' (5'-RACE GSP) и 5'-CAGCGCTCGACACGGACTCATTGTC-3' (3'-RACE GSP). Продукты RACE очищали и клонировали в векторе pGEM T-easy ("Promega"), а затем секвени-ровали.
Нуклеотидные последовательности кДНК анализировали с помощью программного обеспечения GenScan (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html). Аминокислотную последовательность белка предсказывали и анализировали с помощью программы Conserved Domain Architecture Retrieval Tool из пакета BLAST на сервере Национального центра биотехнологической информации (NCBI, http://www.nc-bi.nlm.nig.gov/BLAST).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Согласно данным дифференциального дисплея мРНК, один ген, обозначенный ЕБТ102, или ген 102, умеренно экспрессируется в спинной жировой ткани и не экспрессируется в длиннейшей мышце спины свиней породы Мейшан. Этот же ген практически не экспрессировался в спинной жировой ткани и умеренно экспрессировался в длиннейшей мышце спины свиней породы Крупная Белая (рис. 1).
Ген 102 —
Рис. 1. Различия в экспрессии гена 102 в длиннейшей мышце спины и в спинной жировой ткани свиней пород Мейшан и Крупная Белая. 1 и 2 - длиннейшая мышца спины у свиней породы Крупная белая и Мейшан соответственно. 3 и 4 - спинная жировая ткань пород Крупная Белая и Мейшан соответственно.
Полуколичественная ОТ-ПЦР
Фрагмент дифференциально экспрессирующе-гося гена выделили из геля, провели повторную амплификацию с олиго(dT)-праймером и случайными праймерами, использованными для дифференциального дисплея. Получили ПЦР-продукт размером 631 п. н., что хорошо согласуется с результатами дифференциального дисплея мРНК. Очищенный
ПЦР-продукт клонировали в Т-векторе, и полученную рекомбинантную плазмиду секвенировали. Затем провели ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к EST102. Результаты полуколичественной ОТ-ПЦР (рис. 2) показали, что ген 102 умеренно экс-пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.