МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, том 42, № 2, с. 265-274
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 522.21
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА HSC70 ТИХООКЕАНСКОЙ БЕЛОЙ КРЕВЕТКИ
Litopenaeus vannamei
© 2008 г. R. Wu, Y. Sun, L. M. Lei, S. T. Xie*
Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou, 510632 China
Поступила в редакцию 06.04.2007 г.
Принята к печати 09.06.2007 г.
Белки теплового шока 70 (HSP70) - основные шапероны, необходимые для жизни большинства организмов. С целью изучения функции HSP70 и ответа на тепловой шок клонирован и охарактеризован ген HSC70 белой креветки Litopenaeus vannaemi, содержащий открытую рамку считывания из 1959 п.н. Белок, кодируемый этим геном, имеет молекулярную массу 71.5 кДа и по аминокислотной последовательности на 80-99.6% гомологичен белкам HSP70 и HSC70 различных организмов. В предполагаемом белке HSC70 креветки найдены участки, характерные для эукариотических HSC70: участок связывания ATP/GTP, цитоплазматическая С-концевая последовательность и повторы GGMP/GAP. С помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции определен уровень экспрессии гена HSC70 в сердце, жабрах, гепатопанкреасе, желудке, кишке и мышцах. Показано, что по уровню базальной экспрессии ген HSC70 подобен гену в-актина. С помощью количественной ПЦР в реальном времени обнаружено, что после воздействия теплового шока в течение 2 ч экспрессия гена HSC70 повышается в гепатопанкреасе (в 4.6 раз), желудке (в 5.9 раз), кишке (в 2.6 раза) и мышцах (в 3.5 раза), но не в сердце (в 1.7 раза) и жабрах (в 1.6 раза). Однако высокий уровень экспрессии гена HSC70 в сердце и жабрах наблюдали при продлении теплового шока до 6 ч. Это позволило предположить, что ген HSC70 креветки способен и к кратковременному, и к длительному ответу на тепловой шок. Возможно, ген HSC70 относится к зависимым от температуры членам семейства HSC70. Сконструирован вектор экспрессии, предназначенный для продукции белка HSC70 в клетках Escherichia coli BL21. Рекомбинантный белок перекрестно реагировал с антителами к HSC70 мыши. Полученные данные могут использоваться для изучения молекулярных механизмов ответа на тепловой шок и роли белков теплового шока в защите клеток креветок.
Ключевые слова: HSC70, HSP70, тепловой шок, Litopenaeus vannamei, экспрессия, клонирование.
MOLECULAR IDENTIFICATION AND EXPRESSION OF HEAT SHOCK COGNATE 70 (HSC70) IN THE PACIFIC WHITE SHRIMP Litopenaeus vannamei, by R. Wu, Y. Sun, L. M. Lei, S. T. Xie* (Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou, 510632 China; *е-mail: xieshutao@yahoo.com.cn). Heat shock protein 70s (HSP70s) are fundamental chaperone proteins that are indispensable to most living organisms. In order to investigate the function of HSP70 and heat shock response in shrimp, a heat shock cognate (HSC70) gene of the white shrimp (Litopenaeus vannamei), containing a 1959-bp open reading frame, was cloned and characterized. The amino acid sequence, 71.5 kDa of molecular weight, shares 80-99.6% homo-logy with 12 diverse species' HSP70s and HSC70s. In fact, some segments of the eukaryotic HSC70 sequence, such as ATP/GTP-binding site, cytoplasmic HSP70 C-terminal sequence, and GGMP/GAP repeats, are also found in the putative shrimp HSC70. Moreover, multi-tissue RT-PCR was performed to assay the basal expressions of HSC70 in the heart, gill, hepatopancreas, stomach, gut, and muscle. The results demonstrate that the basal expressions of HSC70 in theses organs are similar to that of в-actin. Furthermore, quantitative real-time experiments showed that HSC70 was up-regulated in hepatopancreas (4.6-fold), stomach (5.9-fold), gut (2.6fold), and muscle (3.5-fold) but not in the heart (1.7-fold) and gill (1.6-fold) after 2 h of heat shock. Nevertheless, the HSC70 was found to be highly expressed in the heart and gill following 6 h of heat shock. This suggests that HSC70 in white shrimp possess both short-term and long-term responses to heat shock stress, indicating this HSC70 may be a heat-dependent HSC70 member. Finally, we constructed an expression vector to generate HSC70 in Escherichia coli BL21, which displayed immune cross-reactivity with mouse HSP70 antibody. In conclusion, the identification and expression of white shrimp HSC70 gene present useful data for studying the molecular mechanism of heat shock response and the effect of heat shock proteins in shrimps' cytoprotec-tion.
Key words: HSC70, HSP70, heat shock, Litopenaeus vannamei, expression, cloning.
Принятые сокращения: SDS - додецилсульфат натрия; RACE - метод быстрой амплификации концов кДНК.
* Эл. почта: xieshutao@yahoo.com.cn
Белки теплового шока (HSP), впервые найденные у Drosophila busckii, быстро синтезируются в ответ на воздействие стресса [1]. Повышенный интерес к роли HSP возник, когда показали, что HSP действуют как шапероны, защищая клеточные белки от денатурации [2, 3]. Семейство HSP включает в себя белки HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, а также другие HSP с более низкой молекулярной массой [4]. Группа белков HSP70 - одна из наиболее хорошо изученных, поскольку во многих физиологических процессах именно эти белки функционируют как основные шапероны [5, 6]. У эукариот есть два вида генов HSP70: один кодирует индуцибельный стрессовый белок HSP, а другой - конститутивный белок, названный HSC (heat shock cognate) [7].
Изучение эукариотического белка HSC70 выявило взаимосвязь между уровнем мРНК HSC70 и приобретаемой организмом степенью устойчивости к стрессу [8-10]. Действительно, индуцированная экспрессия HSC70 придает организмам устойчивость к другим стрессовым факторам. Например, у животных, стимулированных тепловым шоком, повышается устойчивость к экстремальным температурам, осмотическому шоку, вирусным инфекциям, действию тяжелых металлов [11, 12]. В связи с ухудшением качества воды и развитием рыболовства и рыбоводства водные организмы, в том числе креветки, подвергаются воздействию все новых неблагоприятных факторов - колебаниям температуры и солености воды, перегрузке кормовой базы, отравлению химическими веществами, в результате чего как никогда высока частота возникновения болезней и гибели [13-15]. Следовательно, необходимо изучить механизм ответа на стресс у этих организмов. Понимание связи между ответом на стресс и приобретенной устойчивостью к вредным факторам поможет более эффективно бороться с заболеваниями водных животных в рыбоводческих хозяйствах. С помощью молекулярных методов клонированы гены HSC70 двустворчатого моллюска [16], ракообразного [17] и рыбы [18], изучены их экспрессия и функции.
Креветка Litopenaeus vannamei, родина которой восточный тихоокеанский регион Америки, стала одним из основных видов аквакультуры в Азии и особенно в Китае. В настоящее время в базе данных GenBank представлены лишь две нуклеотидные последовательности кДНК, представителей семейства Penaeidae - Penaeus monodon [19] и Fenneropenaeus chinensis [20]. Ген HSC70 L. vannamei амплифицирован непосредственно с геномной ДНК [21], но тканевая специфичность его экспрессии, так же как и экспрессии гена HSP70 не изучена. Наши предварительные опыты показали, что температурный стресс заметно повышает устойчивость L. vannamei к действию летальных температур и искус-
ственному заражению вирусом синдрома белой пятнистости (white spot syndrome virus, WSSV) [12]. Эти интересные результаты могут указывать на функции белка HSP70. Для определения роли белка HSP70 in vivo необходимо изучить структуру его гена и особенности экспрессии мРНК. В данной работе мы клонировали и охарактеризовали ген HSC70 креветки L. vannamei, подвергнутой температурному стрессу, сконструировали прокариотическую систему экспрессии этого гена и оценили уровень экспрессии гена HSC70 в сердце, жабрах, гепатопанкреасе, желудке, кишке и мышцах. С помощью ПЦР в реальном времени определили относительный уровень мРНК HSC70 в шести тканях креветки, подвергнутой тепловому шоку.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Суммарную РНК выделяли из тканей взрослых креветок с помощью реагента TRIzol ("Invit-rogen") согласно протоколу изготовителя. Каждый образец РНК (3 мкг) обрабатывали ДНКазой (свободная от РНКаз ДнКаза RQ1, "Promega") и использовали для обратной транскрипции и получения кДНК с помощью фермента ReverTra Ace MMLV ("Toyoba").
Клонирование с помощью метода RACE и секве-нирование. Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена HSC70 плодовой мушки (L01501), человека (P11142) и тигровой креветки (AF474375) позволило нам обнаружить два консервативных участка. В соответствии с последовательностью этих консервативных участков гена HSC70 синтезированы специфичные праймеры Fd и Rd (табл. 1).
ПЦР проводили с 5 ед. акт. ДНК-полимеразы KOD plus ("Toyoba") в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2.5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР, 200 мкМ каждого dNTP, 0.4 мМ праймеров Fd и Rd и 1 мкл кДНК жабер в качестве матрицы, по следующей схеме: начальная денатурация -2 мин при 94°С; 35 циклов амплификации (20 с при 94°С, 30 с при 58°С, 70 с при 72°С); и заключительная элонгация - 72°С, 10 мин. Амплифици-рованный фрагмент ДНК клонировали в векторе pMD18-T ("TaKaRa") и секвенировали на приборе ABI 3730 ("Applied Biosystems").
кДНК HSC70 получали с помощью 5'- и 3'-RACE. В случае 5'-RACE 5'-конец кДНК жабер достраивали с помощью dCTP и концевой дезоксинуклео-тидилтрансферазы ("TaKaRa"). кДНК, содержащую поли(С)-конец, использовали в качестве матрицы в первом раунде ПЦР с адапторным праймером AAP и специфичным для L. vannamei праймером NR1. Продукт первого раунда ПЦР разводили в 100 раз и использовали в качестве матрицы для второго раунда, который проводили с универсальным праймером AR и специфичным
Таблица 1. Праймеры, использованные для клонирования, секвенирования, экспрессии в прокариотических клетках и количественного анализа экспрессии гена HSC70 L. vannamei
Праймер Нуклеотидная последовательность Ориентация n
Fd 5'-GCCCTCCTACGTCGCCTTCA-3' SN
Rd 5'-CACACCTGGCTGGTTGTCAG-3' AS
Клонирование, 3'-RACE
NF1 5'-GAAGTCCCTCCGTGATGCG-3' SN
NF2 5 'CAAGTCCATCAACCCCG
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.