МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 4, с. 442-447
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 575.113:575.174.015.3
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДУСТРИАЛЬНО ВАЖНОГО ШТАММА ОвЛТЛЕЛ РЛДЛРОЬУМОЯРИЛ
© 2013 г. Е. С. Наумова*, **, К. В. Дмитрук***, Б. В. Кшановская***, А. А. Сибирный***, ****, Г. И. Наумов*, **1
*Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва **Научно-исследовательский и учебно-методический центр биомедицинских технологий ВИЛАРРАСХН, Москва
***Институт биологии клетки НАНУкраины, Львов ****Жешувский университет, Жешув, Польша Поступила в редакцию 23.08.2012 г.
В процессе изучения пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae был изолирован термоустойчивый штамм 1-IR как посторонняя микрофлора промышленного штамма "Red" (Голландия). С помощью секвенирования домена D1/D2 26S рДНК штамм был отнесен к виду Ogataea parapolymorpha. Установлено, что штамм 1-IR способен к эффективной ферментации глюкозы и ксилозы при повышенной температуре 45°С. По этим показателям штамм 1-IR превосходит термоустойчивые дрожжи O. polymorpha CBS 4732, NCYC 495 и O. parapolymorpha DL1. Обсуждается перспектива использования дрожжей O. parapolymorpha в качестве продуцентов топливного биоэтанола из лигноцеллюлозных отходов сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности.
Ключевые слова: виды-двойники Ogataea ащш1а, О. рагаро1утогрка и О. ро1утогрка; В1/02 268 рДНК; термоустойчивость; топливный этанол; ферментация глюкозы и ксилозы.
DOI: 10.7868/S0026365613030129
Нетрадиционные промышленно важные дрожжи Ogataea/Hansenula polymorpha являются объектом интенсивных генетических и молекулярно-биологических исследований [1—11]. Привлекает внимание их термоустойчивость, метилотрофность и активная ферментация глюкозы и ксилозы. В последние годы наблюдается повышенный интерес к изучению этих дрожжей как потенциальных продуцентов топливного этанола из лигноцеллю-лозных отходов сельского хозяйства и деревообрабатывающей промышленности [7, 12, 13]. Конверсия лигноцеллюлозы в спирт традиционно проходит в два этапа. В процессе осахаривания исходное сырье обрабатывается целлюлазами и гемицеллюлазами при повышенной температуре 45—50°C, оптимальной для работы гидролитических ферментов. На втором этапе происходит микробиологическая ферментация сахаров гид-ролизатов лигноцеллюлозы в этанол. Экономически выгодно объединение процессов гидролиза и ферментации, что требует использования термоустойчивых штаммов [14].
Систематическое положение метилотрофных дрожжей подвергалось частым ревизиям: пересматривался их родовой и видовой статус. На основании секвенирования генов 18S и 26S рРНК
1 Автор для корреспонденции (e-mail: gnaumov@yahoo.com).
метилотрофные дрожжи были отнесены к трем новым родам Ogataea, Kuraishia и Komagataella [15, 16]. Данные генетического анализа продемонстрировали гетерогенность таксона O. polymorpha, объединяющего несколько близкородственных видов-двойников [17—19]. Последующий филогенетический анализ молекулярных маркеров подтвердил существование этого комплекса биологических видов [20—23]. В настоящее время описаны три близкородственных вида: O. polymorpha (syn. O. thermophila Peter et al. [24]), O. angusta и O. parapolymorpha. Осталось не до конца ясным положение изолятов из кактусов [25—27], имеющих пониженный уровень ДНК-ДНК реассо-циации с типовой культурой O. angusta CBS 7073 и типовым штаммом Candida parapolymorpha NRRL Y-7560, соответственно, 64 и 72% [28]. Последний штамм выделен из ила и воды загрязненной реки и представляет собой несовершенную форму дрожжей O. parapolymorpha. Кактусовые штаммы генетически изолированы от видов O. angusta, O. polymorpha и отличаются от них кариотипиче-ски и UP-PCR профилями [19].
Целью настоящего исследования является моле-кулярно-генетическая идентификация промыш-ленно важного штамма O. parapolymorpha 1-IR. Нами показано, что этот штамм способен к эффективной ферментации основных сахаров лигноцеллюлозных
Таблица 1. Происхождение изученных штаммов дрожжей
Штамм, видовое название Источник и место выделения
Оригинальный номер штамма Номер в других коллекциях
Ogataea angusta
CBS 7073 (T) NRRL Y-2214 Drosophilapseudoobscura, США
Ogataea parapolymorpha
NRRL YB-1982 (T) CBS 12304 Буровая мука осины, США
DL1 NRRL Y-7560 = ATCC 26012 Ил и вода реки, США
1-IR Посторонняя микрофлора пекарского штамма "Red",
Украина
Ogataea polymorpha
CBS 4732 (T) NRRL Y-5445 Почва, Бразилия
NCYC 495 CBS 1976 = NRRL Y-1798 Испорченный апельсиновый сок, США
Saccharomyces cerevisiae
ВКМ Y-381 Раса XII Спиртовые дрожжи
Сокращенное название коллекций: ВКМ — Всероссийская коллекция микроорганизмов, Москва; ATCC — American Type Culture Collection, Манассас, США; CBS — Centraalbureau voor Schimmelcultures, Утрехт, Голландия; NCYC — National Collection of Yeast Cultures, Норидж, Англия; NRRL — Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization Research, Пеория, Иллинойс, США. T — типовая культура.
гидролизатов растительной биомассы при повышенной температуре.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и среды. Изученные в работе штаммы представлены в табл. 1. В качестве видовых тестеров дрожжей рода Saccharomyces использовались моноспоровые культуры следующих штаммов: S. cerevisiae X2180-1A, S. arboricola CBS 10644, S. bayanus ВКМ Y-1146, S. cariocanus UFRJ 50816, S. kudriavzevii NBRC 1802, S. mika-tae NBRC 1815 и S. paradoxus CBS 432. Дрожжи культивировали на полной среде YPD (0.5% дрожжевой экстракт, 1% пептон, 2% глюкоза) или минимальной среде YNB (Yeast Nitrogen Base компании "Difco", США) без аминокислот (0.67%); в качестве источника углерода использовали 2% глюкозу, 2% ксилозу либо 1% метанол. Для культивирования штамма NCYC 495, маркированного ауксотрофной мутацией leu1-1, в минимальную среду добавляли лейцин в концентрации 40 мг/л.
Для проведения алкогольной ферментации глюкозы и ксилозы дрожжевую биомассу наращивали в полной среде YPD/YPX (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 4% глюкоза/ксилоза) 1—2 сут на орбитальном шейкере (200 об./мин) при температуре 41°С. Биомассу (2 мг/мл клеток) переносили в минимальную среду с добавлением 10% глюкозы или 12% ксилозы. Алкогольную ферментацию проводили на шейкере при температуре 45°С в условиях ограниченной аэрации (140 об./мин).
Концентрацию этанола в среде определяли с помощью набора "Алкотест" [29]. Биомассу определяли турбидиметрическим анализом на фото-электроколориметре ФЭК-56М (кювета 3 мм, светофильтр № 6), используя гравиметрическую калибровку. Все опыты проводили в трех повтор-ностях.
Полимеразную цепную реакцию осуществляли на ДНК-амплификаторе Терцик ("ДНК-Технология", Россия) непосредственно на дрожжевых клетках. Небольшое количество (на кончике микробиологической петли) биомассы дрожжей суспендировали в 30 мкл буфера, содержащего 3 мМ MgCl2, 0.3 мМ дНТФ, 50 пмоль каждого из праймеров. Полученную смесь выдерживали при 95°C в течение 15 мин для лизиса клеток, затем добавляли 2.5 единицы Taq-полимеразы ("Син-тол", Россия). Для амплификации домена D1/D2 26S рДнК и 5.88-ГГ8-фрагмента использовали следующие пары праймеров: NL-1/ NL-4 (GCATATCAATAAGCGGAGGAAAG и GGTCCGTGTTTCAAGACGG), ITS1/ITS4 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG и 5'-TCCT-CCGCTTATTGATATGC. ПЦР (30 циклов) проводили в следующем режиме: денатурация при 94°C — 45 с, отжиг праймеров при 52°C — 30 с, синтез ДНК при 72°C — 120 с. Продукты амплификации подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле при 60-65 В в 0.5х TBE буфере (45 мМ трис, 10 мМ ЭД-ТА, 45 мМ борная кислота) в течение 1.5 ч и окрашивали бромистым этидием.
Секвенирование и филогенетический анализ. Нук-леотидные последовательности домена D1/D2 определяли по двум цепям с помощью прямого се-квенирования по методу Сенгера на автоматическом секвенаторе "Beckman-Coulter" (США). Поиск гомологии с известными нуклеотидными последовательностями проводили в программе BLAST. Множественное выравнивание полученных и уже известных нуклеотидных последовательностей осуществляли вручную с использованием программы BioEdit. Построение филогенетического древа проводили при помощи программы Neighbor-Joining из пакета MEGA 5 [30]. Индексы бутстрепа, определяющие статистическую достоверность выделения групп, определяли для 1000 псевдореплик.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Выделение и идентификация. Анализируемый штамм 1-IR был изолирован как посторонняя микрофлора промышленных пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae "Red" (Голландия), полученных со Львовского дрожжевого завода. При рассеве и культивировании штамма "Red" на полной агаризованной среде при 42°C были обнаружены колонии, клетки которых при микроско-пировании выглядели мельче типичных клеток сахаромицетов. Штамм-контаминант 1-IR был способен расти при более высоких температурах (до 48°С), а также рос на средах с ксилозой и метанолом, что не характерно для дрожжей Saccharomyces.
В настоящее время род Saccharomyces включает семь видов: S. cerevisiae, S. arboricola, S. bayanus, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae и S. paradoxus [31]. Фенотипически не различимые виды Sac-charomyces можно дифференцировать c помощью секвенирования или рестрикционного анализа 5.8S-ITS участка, включающего ген 5.8S рРНК и внутренние транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 [32, 33]. Мы провели амплификацию 5.8S-ITS-фрагментов у штамма 1-IR и семи видовых тестеров Saccharomyces. Размер полученных ПЦР-продуктов был одинаковым у всех видовых тестеров Saccharomyces — примерно 850 п.н., тогда как 5.8S-ITS-фрагмент штамма 1-IR составил около 750 п.н. (рисунок не приводится). Это подтвердило, что последний штамм не относится к роду Saccharomyces.
В современной таксономии дрожжей для определения видовой принадлежности штаммов применяют секвенирование домена D1/D2 26S рДНК [34]. Создана компьютерная база данных нуклео-тидных последовательностей этого участка рДНК, которая используется для определения таксономического положения новых штаммов. Для определения видовой принадлежности штамма 1-IR мы провели секвенирование дом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.