НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 1, с. 36-41
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 615.256.5.015.4:616.831-005.4-036.1-047.58
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ СЕЛЕКТИВНОГО МОДУЛЯТОРА ЭСТРОГЕНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ - ТАМОКСИФЕНА В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ОСТРОЙ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ИШЕМИИ © 2014 г. С. В. Павлов*, И. Ф. Беленичев
Запорожский государственный медицинский университет, г. Запорожье, Украина
В статье авторами исследован нейрохимический профиль нейропротективного действия селективного модулятора эстрогеновых рецепторов — тамоксифена цитрата на модели острой церебральной ишемии (ОЦИ). Показано, что моделирование ОЦИ сопровождается выраженными патобиохими-ческими изменениями в мозговой ткани: резкое смещение тиол-дисульфидного равновесия, интенсификация процессов свободнорадикального окисления, нарушения синтеза цитопротективных белков теплового шока №р 70. Курсовое введение экспериментальным животным тамоксифена цитрата в дозе 1 мг/кг, приводило к нормализации показателей тиол-дисульфидной системы, за счет повышения уровня глутатиона в мозговой ткани, что в свою очередь ограничивало развитие окси-дативного и нитрозильного стрессов. Кроме того, методом иммуноблоттинга показана способность тамоксифена цитрата статистически достоверно повышать содержание №р 70 белков в мозговой ткани, обусловленное его геномными и внегеномными эффектами. Установленный нами нейро-протективный профиль тамоксифена цитрата обусловливает дальнейшую перспективность исследований в данном направлении, с целью внедрения его в клиническую практику в качестве нейропротективного средства.
Ключевые слова: селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов, острая ишемия головного мозга, Шр 70-белки, нейропротективное действие.
DOI: 10.7868/S1027813313040079
Половые гормоны являются ключевыми в системе нормального функционирования организма, начиная с оплодотворения и дифференцировки до процессов старения. Исторически сложилось так, что детально было изучено биологическое действие эстрогенов на развитие вторичных половых признаков у самок, митотическую активность в матке, стимуляцию роста протоков в груди, пролиферацию фолликулярных гранулезных клеток яичников [1]. Однако обнаружение рецепторов к эстрогенам в тканях, не являющихся классическими мишенями, свидетельствуют о том, что эстрогены регулируют не только репродуктивные процессы. В частности, показано защитное влияние эстрогенов на костную ткань, сердечно-сосудистую и центральную нервную системы [2, 3]. В последнее время появились данные о нейропротективном действии эстрогенов [4—6]. Кроме того, ряд исследователей отмечают, что в основе патогенеза нейродеструктивных заболеваний лежит недостаточное количество эстрогенов. Об этом свидетель-
*Адресат для корреспонденции: 69035, Украина, Запорожье, пр. Маяковского, 26, e-mail: zsmu.smu@yandex.ua.
ствует то, что нарушения когнитивных функций встречаются чаще у женщин в период менопаузы, когда выработка эстрогенов, в частности эстрадио-ла, практически прекращается [7]. Исследованиями на лабораторных животных показано наличие терапевтического эффекта у препаратов эстрогенов при патологии ЦНС. Имеются также некоторые эпидемиологические данные о возможном нейро-протекторном эффекте заместительной терапии эстрогенами у женщин в периоде постменопаузы
[7, 8].
Известно, что прямое воздействие эстрогенов на органы и ткани обеспечивается рецепторно опосредованным путем. В настоящее время исследователями отчетливо идентифицируются различные рецепторы эстрогенов (ER-a, ER-P). Так, ER- a локализуются преимущественно в яичниках, матке, печени, почках, надпочечнике, макрофагах, СЭ8-Т-лимфоцитах (супрессоры), вентромедиальных и аркуатных ядрах гипоталамуса. ER-P — в супраоптических и паравентрику-лярных ядрах гипоталамуса, гиппокампе в области полей СА1 и САЗ, зубчатой извилине, не-окортексе, базальных ядрах, обонятельных
луковицах, ядре ложа терминальной полоски, шве среднего мозга, мозжечке [9, 10].
В связи с этим устоявшееся положение о прямом участии половых гормонов только в регуляции репродуктивной системы и в модуляции полового поведения через гипоталамические структуры на сегодняшнее время требует пересмотра и расширения сфер влияния данного гормона.
Рядом экспериментальных работ как зарубежных, так и отечественных исследователей были предприняты попытки установить как профиль нейроактивного действия эстрогенов, так и механизмы их нейропротективного действия. Однако следует отметить, что данные исследования не носили системного характера, многие авторы указывали лишь на антиоксидантный спектр действия эстрогенов. Кроме того, изучение молеку-лярно-биохимических путей нейроактивного воздействия эстрогенов проводилось преимущественно в опытах in vitro. Таким образом, дальнейшее изучение нейропротективной активности эстрогенов представляется актуальным. В последнее время появились данные о выраженном нейропротективном действии селективных модуляторов эстрогеновых рецепторов (SERM), таких как тамоксифена цитрат, ливиал, обусловленном активацией b-ER мозга [6, 11, 12]. Однако нейрохимический механизм подобного действия неясен. Исследованиями последних лет рассматривается гипотеза участия белков теплового шока (Hsp) в механизмах защиты нейронов, а также регуляции процессов клеточной гибели в условиях нейродегенерации. Некоторыми исследованиями in vitro продемонстрирована способность SERM активировать синтез Hsp 70-белка опосредованно, через активацию PER головного мозга
[1, 4, 6].
Цель настоящего исследования — установление механизмов нейропротективного действия SERM и возможной роли Hsp 70-белка в их реализации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальная часть выполнена на белых нелинейных крысах-самцах массой 180—200 гр., полученных из питомника ГО "Институт фармакологии и токсикологии" АМН Украины. Животных содержали на стандартном рационе вивария при естественной смене дня и ночи. Все процедуры и оперативные вмешательства осуществляли в соответствии с "Положением об использовании лабораторных животных в биомедицинских исследованиях". Острую церебральную ишемию (ОЦИ) вызывали необратимой двусторонней перевязкой общих сонных артерий под тиопентал-натриевым наркозом (40 мг/кг) [13].
С целью установления нейропротективного профиля SERM был использован тамоксифена цитрат (1-[пара-[2-(диаметиламино)-этокси]-фе-нил]-транс-1,2-дифенил-1-бутен), который в дозе 1 мг/кг проявляет агонистическую активность в отношении P-ER [14]. Экспериментальным животным препарат вводили внутрибрюшинно в течение 4 сут (острый период).
Животные были распределены в следующие экспериментальные группы:
1) интактная группа животных (n = 10);
2) контроль 1 и 4 сут — животные с острой церебральной ишемией на 1 и 4 сут эксперимента (n = 10);
3) животные с острой церебральной ишемией на 1 и 4 сут на фоне курсового назначения тамоксифена цитрата в дозе 1 мг/кг (n = 10).
О выраженности патобиохимических процессов мозговой ткани при ОЦИ судили по концентрации в головном мозге глутатиона (Глут), гомо-цистеина (GCS), нитротирозина (НТЗ). Содержание в головном мозге Глут определяли флюорометрически; GCS — спектрофотометриче-ски, энзиматическим методом; НТЗ — иммуно-ферментным методом, основанным на энзимосвя-занной иммуносорбции, с использованием метода "сэндвича" [13].
Концентрацию в тканях головного мозга Hsp 70-белка определяли методом Вестерн-блот-ана-лиза. Белки разделяли в 10%-ном полиакрила-мидном геле (ПААГ). Перенос белков с ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли электроэлюцией в течение 45 мин. Преинкуба-цию Вестерн-блотов проводили в растворе TBST с 5%-ным обезжиренным молоком в течение 1 ч. Затем вестерн-блоты инкубировали в присутствии первичных моноклональных антител (Santa Cruz Biotechnology) против Hsp в разведении 1 : 1000 в течение 1 ч. После отмывки блоты инкубировали в присутствии вторичных антител (Santa Cruz Biotechnology), конъюгированных с перокси-дазой хрена (разведение 1 : 2000) в течение 1 ч. Детекцию HIF и Hsp осуществляли при помощи ден-ситометрии в программе Adobe Photoshop [13].
Выраженность неврологического дефицита определяли по шкале McGrow [13]. Тяжесть состояния определяли по сумме соответствующих баллов: до 3 баллов — легкая степень, от 3 до 7 баллов — средняя степень и от 7 баллов и выше — тяжелая степень. Отмечали парезы, параличи конечностей, тремор, манежные движения, птоз, положение на боку, подвижность.
Нормальность распределения оценивали по критериям Kolmogorov— Smirnov (D) и Lilliefors, Shapiro—Wilk (W). В случае распределения, отличающегося от нормального, или анализа порядковых переменных использовали Mann—Whitney U для двух несвязанных выборок, для большего числа выборок— критерий Kruskal—Wallis H с дальней-
Таблица 1. Содержание в тканях головного мозга глутатиона, гомоцистеина, нитротирозина на 4 сут ОЦИ и на фоне введения тамоксифена цитрата (1 мг/кг)
Серии животных (n = 10) Глут., мкм/гр/ткани, (M ± m) GCS, мкм/гр/ткани, (M ± m) НТЗ, усл.ед./гр/белка, (M ± m)
Интакт 4.4 ± 0.56 1.1 ± 0.09 1.25 ± 0.16
Контроль, ОЦИ, 4 сут 2.1 ± 0.17* 4.8 ± 0.15* 6.5 ± 0.18*
ОЦИ 4 сут + Тамоксифена 3.8 ± 0.14** 2.3 ± 0.12** 2.0 ± 0.17**
цитрат (1 мг/кг)
Примечания. *p < 0.05 по отношению к интактным крысам по критерию Mann—Whitney U; **p < 0.05 по отношению к контролю по критерию Mann—Whitney U.
шим сравнением по Games—Howell. Сравнение групп по качественному признаку проводили при помощи критерия х2 с анализом таблиц сопряженности. Данные представлены в виде среднего арифметического и стандартной ошибки репрезентативности среднего значения. Взаимосвязь между исследуемыми переменными проводили, используя процедуру бинарного регрессионного анализа. Результаты исследования обработаны с применением статистического пакета программы "SPSS 16", "Microsoft Excel 2003", "STATISTICA® for Windows 7.0" (StatSoft Inc.), для всех видов анализа статистически значимыми считали различия при уровне значимости менее 0.05 [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенными экспериментальными исследованиями установлено, что моделирование ОЦИ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.