МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 1, с. 63-71
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.252.5
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ-ДЕСТРУКТОРОВ БИФЕНИЛА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ а-СУБЪЕДИНИЦЫ БИФЕНИЛ 2,3-ДИОКСИГЕНАЗЫ
© 2014 г. Е. С. Шумкова*, Д. О. Егорова*, Е. С. Корсакова*, Л. В. Дорофеева**, Е. Г. Плотникова*, 1
*Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь **Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМ), Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 16.05.2013 г.
Исследованы бактерии-деструкторы бифенила/хлорированных бифенилов (ХБ) родов Rhodococcus и Pseudomonas, выделенные из техногенных почв, загрязненных (хлор)ароматическими соединениями. Определено филогенетическое положение бактерий на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. В клетках родококков выявлены плазмиды большой молекулярной массы (220—680 т.п.н.). ПЦР-скрининг на наличие у исследуемых бактерий гена bphAl — генетического маркера, предполагающего возможность индукции в клетках бифенил 2,3-диоксигеназы (подсемейство бифенил/толуол диоксигеназ), показал, что бактерии рода Pseudomonas и большинство бактерий рода Rhodococcus содержат bphAl-гены, имеющие 99-100%-ное сходство с гомологичными генами бактерий соответствующих родов. У штамма Rhodococcus sp. G10 идентифицирован уникальный ген bphAl, ранее не описанный у родококков. Отсутствие специфической амплификации bphAl-генов у ряда бактерий-деструкторов бифенила (Rhodococcus sp. B7b, B106a, G12a, P2kr, P2(51), P2m), в том числе активного деструктора ХБ, Rhodococcus ruber P25, указывает на отсутствие генов, кодирующих белки подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ, и участие в разложении бифенила/ХБ ферментов, отличающихся от белков данного подсемейства.
Ключевые слова: бактерии-деструкторы, бифенил, хлорированные бифенилы, плазмиды, bphAl, Rhodococcus, Pseudomonas.
DOI: 10.7868/S0026365614010133
Антропогенное загрязнение окружающей среды устойчивыми токсичными соединениями является одной из наиболее острых экологических проблем. К числу широко распространенных поллютантов относятся полихлорированные би-фенилы (ПХБ) — высокотоксичные ароматические соединения, исключительно устойчивые к физическим и химическим воздействиям. Несмотря на запрет уже в 70-х годах XX века промышленного выпуска и использования ПХБ, до сих пор остается актуальной проблема их утилизации и очистки загрязненных почв и донных осадков. Известно, что бактерии играют важную роль в процессах самовосстановления природной среды, загрязненной различными ароматическими соединениями, в том числе и хлорированными би-фенилами. К настоящему времени выявлены бактерии-деструкторы бифенила и хлорированных бифенилов, относящиеся к различным филогене-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: peg@iegm.ru).
тическим группам. Среди них наиболее полно исследован бидеградационный потенциал грамотри-цательных бактерий, грамположительные бактерии изучены в меньшей степени, однако интерес к ним растет в связи с их возможностями разлагать широкий спектр стойких ксенобиотиков и устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды [1—4].
Метаболизм незамещенного бифенила и его хлорированных производных до стадии бензойной или соответствующей хлорбензойной кислоты у бактерий осуществляется по одному биохимическому пути. Поэтому многие бактерии, утилизирующие бифенил, способны к полной или частичной деградации хлорбифенилов [1]. Бифенил, в связи с меньшей токсичностью по сравнению с его хлор-производными, используется в качестве модельного соединения при изучении ферментов и генетических систем, участвующих в бактериальной деструкции ПХБ. Первую реакцию окисления бифенила/ПХБ, гидроксилирование ароматиче-
ского кольца с образованием (хлор)бифенил-ди-гидродиола, осуществляет бифенил 2,3-диокси-геназа (БДО), являющаяся представителем большого семейства гидроксилирующих диоксигеназ, содержащих кластер Риске и негемовое железо [5]. Это ключевой фермент в бактериальной деструкции бифенила/ПХБ, определяющий спектр конвертируемых бактериями конгенеров ПХБ. БДО состоит из трех больших (а-) и трех малых (ß-) субъединиц (BphAl и BphA2 соответственно), ферредоксина (BphA3) и ферредоксин-редуктазы (BphA3). Поскольку именно а-субъединица отвечает за распознавание субстрата и связывание с ним [1], ген bphAl является важным генетическим маркером аэробных бактерий-деструкторов бифенила/ПХБ.
Изучение таких генетических биомаркеров может дать информацию о биодеградационном потенциале бактерий, а также необходимые знания для решения практических задач (создание штаммов и ферментов с заданными свойствами с целью деструкции поллютантов, диагностики биодеградационных свойств бактериальной популяции, особенно в связи со значительным вкладом некультивируемых форм бактерий в процесс деструкции устойчивых ксенобиотиков). Исследования филогенетических взаимоотношений между ключевыми генами деструкции ароматических соединений помогут получить ответ на вопрос, каким образом бактерии приспосабливаются к меняющимся условиям окружающей среды (например, к появлению в окружающей среде ПХБ) — то есть приблизиться к решению фундаментальных проблем, касающихся эволюции ферментных систем и взаимодействия организма и окружающей среды.
Ранее из техногеннозагрязненных почв нами были выделены бактерии-деструкторы бифенила родов Rhodococcus и Pseudomonas, у которых изучена способность разлагать различные конгенеры ПХБ [6—8]. Целью настоящей работы являлось дальнейшее исследование биодергадационного потенциала изолированных бактерий, в частности, их молекулярно-биологических особенностей: выявление внехромосомных генетических структур (плазмид) и исследование ключевых генов деструкции бифенила (bphAl).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы. В работе использованы бактерии, выделенные из почвы, загрязненной (галоген)ароматическими соединениями (территория ОАО "Галоген", г. Пермь): Rhodococcus sp. Pl, P2m, P2kr, P2(51), P12, P13, P20 [6], Rhodococcus ruber P25(=^m896) [8], Rhodococcus sp. G10 [7]; из почвы, загрязненной ПХБ (г. Серпухов, Московская область): Pseudomonas sp. S13, S210, S211, S212 [6]. Кроме того, в настоящей работе были использованы штаммы бакте-
рий-деструкторов ароматических соединений (из рабочей коллекции лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН), обозначенные как P23a, G12a (почва, ОАО "Галоген", г. Пермь), и штаммы, обозначенные B7b, B106a (почва, ОАО "Уралкалий", г. Березники, Пермский край). Бактерии были выделены из образцов почв методом накопительного культивирования на минеральной среде K1 [9] c бифенилом (1 г/л).
Фенотипические признаки изолированных штаммов изучали по общепринятым методикам [10].
Способность бактерий к росту на ароматических соединениях определяли путем культивирования на агаризованной минеральной среде К1 и в жидкой среде К1 при 28°С с аэрацией на термостати-руемой качалке (100 об/мин). В качестве единственного источника углерода и энергии в жидкую среду добавляли одно из следующих соединений: бензол, толуол (0.5 г/л); бифенил, нафталин (1 г/л). При культивировании бактерий на агаризованной среде субстраты добавляли на крышку перевернутой чашки Петри. Степень роста бактерий оценивали, как описано ранее [7]. Оптическую плотность культур определяли на спектрофотометре Shimadzu TCC-240A (Япония) при длине волны 600 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см.
Плазмидные ДНК выявляли методом пульс-электрофореза с использованием прибора CHEF DR II ("Bio-Rad Laboratories", США) как описано ранее [11].
Выделение тотальной ДНК бактерий-деструкторов проводили по общепринятому методу [12].
Амплификацию генов 16S pPНК с использованием выделенной тотальной ДНК в качестве матрицы проводили со стандартными праймерами f27, r1493 при условиях, описанных в работе M.A. 1иго1а с соавторами [13]. ПЦР осуществляли на приборе My-Cycler ("Bio-Rad Laboratories", США).
Амплификацию bphAl генов, кодирующих а-субъ-единицы ферментов подсемейства бифенил/толу-ол диоксигеназ (Б/Т ДО) [5], осуществляли с использованием вырожденных праймеров bphAi668-3, bphAr1153-2 при условиях реакции, предложных R. Witzig с соавторами [14]. Праймеры подобраны на основе выравнивания известных нуклеотидных последовательностей бактериальных генов а-субъ-единиц терминальной оксигеназы подсемейства Б/Т ДО (bphAl). Участок гена bphAl, ограниченный праймерами, кодирует активный центр фермента [14].
Продукты реакции разделяли методом электрофореза в агарозном геле (1%) при напряжении 10 V/см, окрашивали раствором бромистого эти-дия (5 мкг/мл) и фотографировали в УФ-свете с использованием системы гель-документирования Gel Doc™ XR ("Bio-Rad Laboratories", США).
Таблица 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК штаммов-деструкторов с гомологичными последовательностями типовых штаммов
Штамм Типовой штамм (номер GenBank) Сходстго, %
B7b Rhodococcus erythropolis DSM 43066T (X79289) 99.1
B106a Rhodococcus erythropolis DSM 43066 T (X79289) 100.0
G10 Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082 T (Z37138) 99.0
G12a Rhodococcus erythropolis DSM 43066T (X79289) 98.0
P1 Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082 T (Z37138) 100.0
P2kr Rhodococcus erythropolis DSM 43066T (X79289) 100.0
P2m Rhodococcus erythropolis DSM 43066T (X79289) 99.9
P2(51) Rhodococcus baikonurensis GTC 1041T (AB071951) 100.0
P12 Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082T (Z37138) 99.8
P13 Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082T (Z37138) 99.8
P20 Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082T (Z37138) 100.0
P23a Rhodococcus erythropolis DSM 43066 T (X79289) 100.0
S13 Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T (AB176954) 99.5
S210 Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T (AB176954) 98.9
S211 Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T (AB176954) 98.9
S212 Pseudomonas xanthomarina KMM 1447T (AB176954) 99.0
ДНК-типирование изолятов осуществляли методом BOX-ПЦР по стандартной методике [15].
Секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей. Определение нуклеотидных последовательност
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.