УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2012, том 132, № 5, с. 448-462
УДК 616.9-036.21:577.2
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И ИЗУЧЕНИЕ ФЕНОМЕНА ПРИРОДНОЙ ОЧАГОВОСТИ БОЛЕЗНЕЙ
© 2012 г. Э. И. Коренберг
ФГБУ "НИИэпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России, Москва
E-mail: edkorenberg@yandex.ru
Рассмотрены некоторые наиболее актуальные современные проблемы применения молекулярно-биологических методов при изучении природных очагов, которые в значительной мере определяют дальнейшее развитие исследований в этой области: место молекулярно-биологических методов в систематике и таксономии возбудителей природноочаговых инфекций, их значение для формирования представлений о гетерогенности популяций, входящих в паразитарные системы, для индикации природных очагов и оценки роли различных животных в эпизоотическом и эпидемическом процессах, а также в лабораторной диагностике заболеваний.
Ключевые слова: природная очаговость болезней, молекулярно-биологические методы.
ВВЕДЕНИЕ
Природный очаг - это открытая саморегулирующаяся по принципу отрицательной обратной связи биоценотическая паразитарная система. Позиции автора, касающиеся основных понятий природной очаговости, механизмов и форм резервации возбудителей, путей появления "новых" природноочаговых инфекций, а также стратегии профилактики заболеваний этой группы, изложены ранее [34].
Основной "механизм" саморегуляции природ-ноочаговых паразитарных систем - динамика взаимоотношений генетически детерминированной внутрипопуляционной гетерогенности ее главных компонентов: возбудителя, его резерву-арных хозяев и переносчиков. Это положение, как и вытекающий из него вывод о том, что прогресс в изучении феномена природной очаговости может быть достигнут при сочетании традиционных популяционно-экологических подходов с принципами и методами популяционной генетики, стали понятны довольно давно [27, 28, 29, 110]. Однако методические возможности для реализации такого подхода в те годы были ограничены и, в большинстве случаев, сводились к выявлению и характеристике разнообразия фенотипических признаков.
Широчайший интерес к природноочаговым зоонозам, к их эпизоотологии и эпидемиологии, наблюдающийся сейчас во всем мире, вызванный
открытием многих неизвестных ранее возбудителей и нарастающей интенсивностью эпидемических проявлений природных очагов, совпал с расширением арсенала современных молеку-лярно-биологических методов, применяющихся сейчас для их изучения и диагностики. ДНК-ДНК гибридизация, плазмидный анализ, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее модификации, включая ПЦР в режиме реального времени, полиморфизм длины фрагментов рестрикции (ПЦР-ПДРФ), анализ числа вариабельных локусных тандемных повторов (MLVA - multiple locus variable number tandem repeats analysis), секвенирование генома или, чаще, его различных участков, мультилокус-ный сиквенс анализ (MLSA или МЛСА) и другие молекулярно-биологические методы, несомненно, открыли совершенно новые возможности для исследования феномена природной очаговости. Их активное применение в этих целях не только в научных исследованиях, но и в современной практической диагностической работе лабораторий санэпидслужбы и клинических стационаров [47] - очень отрадное явление. В конечном счете, оно выведет изучение паразитарных систем на совершенно другой уровень.
Вместе с тем, приходится констатировать, что появилась некоторая эйфория, основанная на убеждении, что эти методы сами по себе прояснят ключевые проблемы эпизоотологии и эпидемиологии природноочаговых инфекций. Явственно высветились "болевые точки" и "под-
водные камни", возникающие при их применении и недостаточно продуманной трактовке полученных результатов [34]. Как и в случаях с лекарственными препаратами, это надежду явно или скрыто поддерживают производители различных тест-систем. Уже возникло словосочетание "молекулярная эпидемиология" природноочаговых инфекций [22, 116 и др.], которое представляет собой смешение понятий "метод" и "наука" [83]. Применение ПЦР стало своеобразной "индульгенцией" для совершенно неадекватных заключений, а "ампликоновая" система доказательств нередко сочетается с забвением или игнорированием сути ряда базовых понятий эпизоотологии и эпидемиологии. В этой связи уместно напомнить о беспокойстве Н.П. Дубинина [20, с. 367], выраженном применительно к общим проблемам генетики еще 20 лет назад: "Необходимость использования физико-химических и биохимических методов привела к тому, что разрабатывать проблему молекулярной генетики стали "чистые" биохимики. Это было полезно, но одновременно послужило появлению неправильных суждений о задачах генетики в целом, привело к однобокости в понимании характера значимости работ по общей генетике".
Колоссальная литература, накопившаяся по этому поводу за последние 15-20 лет, нуждается в обстоятельном критическом анализе. Он не может быть проделан в сколько-нибудь исчерпывающем виде в рамках данной публикации в связи с ограниченностью ее объема. Вместе с тем, невозможно обойти молчанием эту актуальную проблему, поскольку ее недооценка приводит к быстрому накоплению "информационного шума". Поэтому цель данной статьи - в самой общей форме и при использовании необходимого минимума ссылок на конкретных примерах обозначить особенно распространенные "перегибы" в трактовках и выводах, которые, как правило, остаются без внимания при обсуждении результатов, полученных молекулярно-биологическими методами применительно к различным аспектам феномена природной очаговости болезней. При этом совершенно сознательно не будет затронут огромный пласт исследований, посвященных геномике, протеомике, генетической регуляции патогенности и резистентности к антибиотикам, а также ряду других проблем, чрезвычайно важных с общебиологических позиций.
Каждый метод имеет, как известно, лабора-торно-технические достоинства и недостатки, которые следует принимать во внимание при оценке полученных результатов. Они подробно описаны во многих специальных публикациях, и
здесь не рассматриваются. Для решения конкретной задачи, разумеется, очень важен правильный выбор адекватных ей методов и их модификаций [148 и др.].
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В СИСТЕМАТИКЕ
И ТАКСОНОМИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ПРИРОДНООЧАГОВЫХ ИНФЕКЦИЙ
Современная систематика прокариот уже немыслима без анализа данных, полученных молекулярно-биологическими методами [117]. Предложены и продолжают обсуждаться критерии отличий нуклеотидных последовательностей определенных генов и их таксономическое значение, на основе которых описаны новые виды или варианты вируса лимфоцитарного хориоминенги-та, лиссавирусов, риккетсий, бартонелл, эрлихий, лептоспир, боррелий, франциселл [2, 88, 93, 95, 96, 115, 131, 141, 142 и др.]. В целом начали "выкристаллизовываться" современные принципы классификации некоторых представителей патогенных прокариот и определения границ прока-риотического вида [13].
Однако нужно учитывать, что обработка данных о структуре генома и построение дендро-грамм программно-математическими способами - это лишь условная математическая модель [15]. В ряде случаев она дает впечатляющие результаты. Ограничусь одним недавним примером: сравнение сиквенсов определенного региона не-кодирующего внутригенного спейсера изолятов спирохет Borrelia dutonii, передающихся аргасо-выми клещами комплекса Ornithodoros moubata, с B. recurrentis - возбудителем вшивого возвратного тифа, которые были получены от больных, позволило сделать заключение, что B. recurrentis представляет собой не самостоятельный вид, а экотип B. dutonii [93]. Таким образом, моле-кулярно-биологическими методами получены данные о таксономическом ранге давно известной B. recurrentis и подтверждена роль вшей в возникновении этого экотипа, а также в передаче возбудителя классическогого аргасового клещевого боррелиоза (АКБ), возможность которой теоретически [14] и экспериментально [73, 74] была обоснована более 45 лет назад.
Тем не менее, современные молекулярные методы сами по себе - это по ряду причин не лучший путь познания родства между различными таксонами микроорганизмов [120]. Однако при обосновании видового таксономического ранга вновь описываемых микроорганизмов именно
такой подход стал не просто главенствующим, но и практически единственным [137]. При этом просто полагают, что если полученная последовательность нуклеотидов ДНК или РНК не соответствует ни одной из депонированных в GenBank или иную базу генетических данных, то она в таксономическом отношении представляет собой что-то новое. Такой предельно упрощенный подход имеет ряд очевидных недостатков [145].
B последние годы прибегают к сравнению результатов секвенирования локусов нескольких генов (их набор может быть различным, но обычно включает так называемые гены "домашнего хозяйства") с сиквенсами аналогичных локусов уже известных видов. Этот подход называют мультилокусным сиквенс-анализом, и он применяется, например, при описании новых видов, при изучении таксономии, филогении, эволюции и внутривидовой "разнокачественности" микроорганизмов [88, 95, 118, 119, 139, 141, 150 и др]. Его преимуществом по сравнению с выводами, которые прежде основывали на сравнении нук-леотидных последовательностей вариабельных участков одного-двух генов, считают большую объективность. Изучение этим методом восьми хромосомальных генов возбудителя болезни Лайма показало, например, что американские штаммы заметно отличаются от европейских, причем, как полагают исследователи [119], B. burgdorferi возникла в Европе, а не в Северной Америке. Однако отсутствуют научные обоснования количества и конкретного набора генов, локусы которых следует секвенировать при изучении таксономии микроорганизмов определенного рода, включающего (реально или потенциально) возбудителей природноочаговых инфекций. Решение этой задачи осложняется несогласованностью критериев вида применительно к некоторым из них (например хантавирусам, лептоспирам). Кроме того, важно учитывать, что возбудители зоонозов - это лишь часть известных сегодня микроорганизмов любой таксономической группы, к котор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.