ГЕНЕТИКА, 2011, том 47, № 12, с. 1611-1615
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.11
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕЛЯ Wx-B1e МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ И ПРИМЕНИМОСТЬ ДНК-МАРКЕРОВ
ДЛЯ ЕГО ИДЕНТИФИКАЦИИ © 2011 г. М. Г. Дивашук, М. В. Климушина, Г. И. Карлов
Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева, Центр молекулярной биотехнологии, Москва 127550 e-mail: divashuk@gmail.com Поступила в редакцию 30.03.2011 г.
Дана молекулярно-генетическая характеристика аллеля Wx-B1e, выявленного авторами у сорта мягкой пшеницы Коротышка. Клонирован и секвенирован фрагмент аллеля Wx-B1e размером 804 пн. При сравнении полученной последовательности с последовательностью аллеля мягкой пшеницы дикого типа (Wx-B1a) было установлено, что аллель Wx-B1е несет инсерцию в 34 пн, делецию в 8 пн и 23 нуклеотидные замены. BLAST анализ выявил наибольшую гомологию с нуклеотидной последовательностью Wx-генов Triticum spelta и Triticum durum. Продемонстрированы варианты амплификации четырех молекулярных маркеров Wx-B1, применяемых в настоящее время в мире для анализа коллекций на различные аллельные варианты Wx-генов.
Гранул-связанная синтаза крахмала (Granule-Bound Starch Synthase I — GBSSI) является ключевым ферментом, обеспечивающим биосинтез линейного полисахарида — амилозы, которая вместе с амилопектином формирует крахмал эндосперма зерновки пшеницы [1—3]. Поскольку мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) относится к алло-гексаплоидным видам (2n = 6x = 42, геномная формула BBAADD), ее геном несет три гомеоло-гичных гена, кодирующих три изоформы GBSSI фермента. Данные гены получили название Wx и расположены на следующих плечах хромосом: 7AS (Wx-A1), 4AL (Wx-Bl) и 7DS (Wx-D1) [4]. Мутации WX-генов влияют на количество амилозы и, соответственно, на физико-химические и функциональные свойства крахмала [5, 6]. У мягкой пшеницы с одним или двумя нефункциональными Wx-генами (нуль-аллелями) синтезируется крахмал с пониженным содержанием амилозы (частично Waxy-крахмал) [7—9]. Было показано, что наибольшее влияние на содержание амилозы и качество конечного продукта оказывают Wx-Bl-гены, а затем уже Wx-D1 и Wx-A1 [10-12].
Помимо нуль-аллелей выявлены различные функциональные аллельные варианты Wx-генов [7, 13-15]. Изучение различных аллельных вариантов Wx-генов имеет большое значение в связи с их потенциальной ценностью для пищевой промышленности, а также при получении биоэтанола. Влияние функциональных аллелей на содержание амилозы мало изучено из-за сложности их выявления и создания линий пшеницы с различными аллельными вариантами.
В мире аллельная вариабельность Жх-генов была охарактеризована у ряда коллекций различных видов пшеницы. Для ее характеристики использовали как одно- или двухмерный гель-электрофорез GBSSI белков [13, 16—18], так и молекулярное маркирование [17, 19, 20]. К настоящему времени для характеристики нефункциональных аллельных вариантов (нуль-аллелей) Жх-генов разработано несколько молекулярных маркеров [12, 14, 20, 21]. Ранее в результате проведенного анализа с помощью молекулярных маркеров, разработанных Макашига с соавт. [20], сорт Коротышка был охарактеризован как носитель нуль-аллеля в локусе Жх-В1 [22]. Однако в 2009 г. был выявлен неописанный ранее аллель — Жх-В1в. При этом молекулярный маркер, разработанный МсЬаисЫап с соавт. [21] для идентификации нуль-аллеля, при амплификации с Жх-В1в давал ложноположительные результаты наличия нефункционального аллеля [14]. При этом прайме-ры, разработанные МсЬаисЫап с соавт. [21], и праймеры, разработанные Макашига с соавт. [20], находятся в одной и той же области гена Жх-В1. Кроме того, было показано, что идентификация аллеля Жх-В1в с помощью одномерного белкового электрофореза затруднена [14].
В данной работе оценена возможность применения набора молекулярных маркеров для выявления аллеля Жх-В1в и представлены результаты молекулярно-генетической характеристики расширенной нуклеотидной последовательности этого аллеля, идентифицированного нами у сорта Коротышка.
1611
1612
ДИВАШУК и др.
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР c праймерами: а — Wx-B1F и Wx-B1R [14]; б — BDFL и BRC1 [12]; в — BDFL и BRD [20]; г - 4F и 4R [21]. 1 - образец Hokkai 252 (Wx-A1a; Wx-B1b; Wx-D1a); 2- сорт Безостая 1 (Wx-A1a; Wx-B1a; Wx-D1a); 3 — сорт Коротышка (Wx-A1a; Wx-B1e; Wx-D1a). Стрелкой отмечен бенд, амплифицирующийся у дикого типа аллеля Wx-B1а.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. В работе использовали семена сорта Коротышка, любезно предоставленные проф. В.П. Нецветаевым. В качестве контроля служил сорт Безостая 1(Wx-A1a; Wx-B1a; Wx-D1a) и образец Hokkai 252 (Wx-A1a; Wx-B1b (нуль-аллель); Wx-D1a).
Выделение ДНК из проростков проводили по методу Bernatzky и Tanksley [23].
ПЦР, клонирование, секвенирование. В работе использовали следующие праймеры: BDFL, BRD [20]; 4F, 4R [21]; BDFL, BRC1 [12]; Wx-B1L, Wx-B1R [14].
Полимеразную цепную реакцию проводили на Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler ("Bio-Rad", США) при условиях, рекомендуемых авторами прайме-ров. 25 мкл реакционной смеси содержали: 1х Taq-полимеразный буфер ("Силекс", Москва), 1.0 U Taq-ДНК-полимеразы ("Силекс", Москва), 200 мкМ каждого dNTP ("Promega"), 0.2 мкМ каждого праймера и 100—150 нг ДНК-матрицы. Концентрация хлорида магния для праймеров 4F, 4R составляла 3.0 мкМ, в остальных случаях — 2.5 мкМ. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в трис-боратном буферном растворе (ТВЕ). В качестве маркера размеров использовали "100 bp Ladder" ("Fermentas", Литва). Лигирование ампли-фицированной ДНК осуществляли в pGEM®-T Easy Vectors. Секвенирование проводили в ЗАО "Синтол".
Выделение крахмала и электрофоретический анализ. Для выделения крахмала зерновки перемалывали и в 20 мг муки добавляли 1 мл дистиллированной воды. Перемешивали и инкубировали 24 ч при 4°С. Гомогенат фильтровали через Miracloth и центрифугировали 1.5 мин при 14 тыс. об/мин. Белки выделяли из крахмала по методу Echt and Schwartz [24]. Полученный крах-
мал отмывали в 1 мл буфера А, содержащего 55 мМ трис-HCl, pH 6.8, 2.3% (w/v) SDS (лаурил сульфат натрия), 2% (w/v) дитиотреитола и 10% (v/v) глицерина. Затем добавляли 1 мл буфера А и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Осадок отмывали 3 раза дистиллированной водой и 1 раз ацетоном, а затем высушивали. После этого смешивали с 80 мкл буфера А, нагревали в течение 2 мин в водяной бане, охлаждали и центрифугировали. Для электрофореза использовали 20 мкл трис-НС1/глицин-буфера, приготовленного по методу Laemmli [25]. Электрофорез выполняли при силе тока 30 мА/гель в течение 6 ч. Полученные гели окрашивали Coomassie Brilliant Blue R-250.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для изучения аллельного состояния локуса Wx-B1 у сорта пшеницы Коротышка были использованы четыре молекулярных маркера, разработанных McLauchlan с соавт. [21]; Nakamura с соавт. [20]; Vanzetti с соавт. [14] и Saito с соавт. [12] (рис. 1).
При амплификации с праймерами, предложенными McLauchlan с соавт. [21] и Nakamura с соавт. [20], было выявлено, что у сорта Коротышка амплифицируются фрагменты, характерные для образца Hokkai 252 — носителя нуль-аллеля гена Wx-B1 (рис. 1, в, г).
При использовании молекулярного маркера, разработанного Vanzetti с соавторами, у сорта Коротышка амплифицировался фрагмент большего размера по сравнению с аллелем дикого типа и соответствовал аллелю Wx-B1e. В то же время у образца Hokkai 252 амплификация отсутствовала, что характерно для нуль-аллеля гена Wx-B1 (рис. 1, a). Молекулярный маркер, разработанный Saito с соавторами, выявил, что у сорта Коротышка при амплификации синтезируются про-
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
1613
М
Wx-A1a -Wx-D1a -
e-Г
—Wx-D1a -Wx-B1a
Рис. 2. SDS-PAGE гель-электрофорез "аху-белков. 1 — сорт Коротышка (Жх-Л1а; Жх-В1в; Жх-В1а); 2 — сорт Безостая 1 (Жх-Л1а; Жх-В1а; Жх-В1а); М — маркер белковых размеров.
дукты несколько большего размера, чем у аллеля дикого типа (Wx-B1a), и отличаются по размеру от нуль-аллеля (рис. 1,5).
При анализе белков, находящихся в крахмале 20-дневных зерновок, было выявлено, что у сорта Коротышка GBSSI (или Waxy) белок, кодируемый геном Wx-B1, имеет меньшую подвижность по сравнению с диким типом Wx-B1a. Его подвижность наблюдалась на уровне аллеля Wx-D1a, что характерно для аллеля Wx-B1e (рис. 2) [14].
Основываясь на данных молекулярного анализа и одномерного электрофореза белков, было установлено, что сорт Коротышка является носителем аллеля Wx-B1e.
До настоящего времени последовательность аллеля Wx-B1e была представлена всего 441 пн [14]. Эта последовательность не перекрывала сайты отжига обратных праймеров для молекулярных маркеров, разработанных Saito с соавт. [12] и Nakamura с соавт. [20], которые в данное время рекомендуются для идентификации нуль-аллелей по гену Wx-B1. В связи с этим нами был клонирован и секвенирован фрагмент размером 804 пн, амплифицируемый с помощью пары прайме-ров BDFL/BRC1, на сорте Коротышка. Выравнивание полученной нами последовательности с более короткой последовательностью (441 пн), полученной ранее на сорте Buck Poncho аргентинской селекции, показало полную идентичность в зоне их перекрытия (рис. 3).
При сравнении с последовательностью аллеля мягкой пшеницы дикого типа Wx-B1a (GenBank AB019623) было выявлено, что изучаемый аллель несет инсерцию 34 пн, делецию 8 пн и 23 нуклео-тидные замены. Но при этом различие по аминокислотной последовательности между аллелем Wx-B1e сорта Коротышка и аллелем дикого типа
1220 *
AGACGTGGTGTTCGTGTGCAACGACTGGCACAO
* 1160 * 1180 — OTGGOOTGOTAOOTOAAGAGOAAOTAOOAGT00A
TTCTGGCCTGCTACCTCAAGAGCAACTACCAGTCCAA
TTCTGGCCTGCTACCTCAAGAGCAACTACCAGTC^G_____
gggcct t CTGGCCTGCTACCTCAAGAGCAACTACCAGTCCAaTGGCATCTATAt GACGGCCAAGGTTTTGCAaCTTCTgAAACTTCATAT
* 1280 * 1300 * 1320
TCTCTCCGCATATCAATTCTTTTGCGGTTCATTCATTCTGGCCTGGATTTTACATTGCAACTCCATTTCATGGATAGGTGGCGTTCTGCATCCACAACATCTCGTACCAGGGCCGCTTCTCCT TCTCTC0GCATATCAATTCTTTTG0GGTTCATTCATTCTGGCCTGGATTTTACATTGCAACT00ATTTCATGGATAGGTGG0GTTCTGCATCCACAACATCT0GTA00AGGGC0GCTTCTCCT TCTCTCЯGCA^^!B^^!^^^^^^^!^^!^^^^!^G2ATTTTACATTG
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.