МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 3, с. 422-429
= МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНЕТИКА =
УДК 575.857:595.122.2(571.6)
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЙ ТРЕМАТОДЫ Skrjabinolecithum spasskii Belous, 1954, (DIGENEA: HAPLOPORIDAE) - ПАРАЗИТА КЕФАЛЕВЫХ РЫБ © 2015 г. Д. М. Атопкин1*, А. Ю. Белодед (Никитенко)1, H. D. Ngo2, N. V. Ha2, N. V. Tang2
1Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук, Владивосток, 690022 2Institute of Ecology and Biodiversity, Vietnamese Academy of Sciences and Technology, Hanoi, Vietnam
Поступила в редакцию 02.12.2014 г.
Принята к печати 17.12.2014 г.
Изучали внутривидовую генетическую дифференциацию, а также филогенетические связи трематоды Skrjabinolecithum spasskii с другими представителями семейства Haploporidae, сравнивая нуклеотидные последовательности участка гена 28S рРНК и фрагмента ITS1-5.8S-ITS2 рДНК. Трематоды выделяли из рыб пиленгасов (Liza haematocheila), пойманных в разных реках Приморского Края, и лобанов (Mugil cephalus) из водоемов Вьетнама (27 особей). Результаты филогенетического анализа указывают на близость трематод S. spasskii к представителям рода Capitimitta, принадлежащего к подсемейству Ware-trematinae. По степени внутривидовой изменчивости последовательностей рДНК особи S. spasskii разделились на три группы, генотипы которых отличаются по фиксированным нуклеотидным заменам. Генотип I обнаружен у особей трематод из пиленгасов, генотип II — из лобанов, собранных в водоемах о. Кат Ба, Вьетнам. Генотип III выявлен у пяти экземпляров трематод из пиленгасов р. Киевка. Дифференциация между приморскими генотипами I и III составляет 0.4% и 0.65%, а между генотипами II и III — 0.1 и 0.33% по маркерам 28S и ITS соответственно. Обсуждаются возможные причины генетической дифференциации S. spasskii из разных географических районов и разных видов окончательных хозяев.
Ключевые слова: трематоды, ПЦР, 28S рДНК, ITS рДНК, 5.8S рДНК, Haploporidae, кефалевые рыбы.
MOLECULAR GENETIC CHARACTERIZATION OF THE FAR EASTERN TREMATODE Skrjabinolecithum spasskii Belous, 1954 (DIGENEA: HAPLOPORIDAE) — A PARASITE OF MUGILID FISHES, by D. M. Atopkin1, A. Yu. Nikitenko1, H. D. Ngo2, N. V. Ha, N. V. Tang ^Institute of Biology and Soil Science, Far East Division, Russian Academy of Sciences, Vladivostok, 690022 Russia, *e-mail: pan2006_82@mail.ru; 2Institute of Ecology and Biodiversity, Vietnamese Academy of Sciences and Technology, Hanoi, Vietnam). Nucleotide sequences of partial 28S rRNA gene and ITS1-5.8S-ITS2 fragment of rDNA were obtained using PCR-based sequencing procedure for 27 specimens of the trematode Skrjabinolecithum spasskii from Liza haematocheila, collected from different rivers of the Primorye Region and from Mugil cephalus, collectedfrom Vietnamese waters. Estimation of intraspecific genetic differentiation of the S. spasskii and phylogenetic reconstructions of the family Haploporidae were performed using these molecular data. Results of the phylogenetic analysis indicate a closeness of the S. spasskii and members of the genus Capitimitta from the subfamilyWare-trematinae. By intraspecific genetic distances between the rDNA sequences S. spasskii specimens were subdivided into three groups, which represent three different genotypes with the fixed nucleotide substitutions. The genotype I was found for specimens of the S. spasskii, collected from L. haematocheila from different rivers of the Primorye Region. The genotype II was detected for trematodes from M. cephalus, collected from the Tonkin Bay, CatBa Island, Vietnam. The genotype III was found for five specimens of the S. spasskii from L. haematocheila from the Kievka River, Primorye Region. Genetic distances between genotypes I and III from Primorye were 0.4 and 0.65% by 28S rDNA and ITS rDNA sequence data, respectively. Smallest genetic distances were revealed between the genotypes II (Vietnam) and III (Primorye): 0.1 and 0.33% by 28S rDNA and ITS rDNA sequence data, respectively. Possible causes of genetic differentiation of the S. spasskii from different geographic locations and different definitive host — species are discussed.
Keywords: trematodes, PCR, sequencing, 28S rDNA, ITS rDNA, 5.8S rDNA, Haploporidae, mugilid fishes. DOI: 10.7868/S0026898415030027
* Эл. почта: pan2006_82@mail.ru
Трематода Skrjabinolecithum spasskii — типичный представитель дигенетических сосальщиков, инфицирующих разные виды кефалевых рыб в Приморском Крае [1]. Этой группе, выделенной впервые из пиленгаса (Liza haematoheila, Tem-mincket Schlegel, 1845, ранее Mugilso-iuy) в реке Раздольная (ранее Суйфун), придали статус нового рода Skrjabinolecithum, Belous, 1954, в котором вид S. spasskii был признан типовым [2, 3]. Недавно найдены трематоды этого вида в р. Раздольная [1], а также в других водоемах Приморского края, у особей пиленгаса (L. haematocheila), а также лобанов (Mugil cephalus, Linnaeus, 1758) — в водоемах Вьетнама. Размеры тела и органов этих трематод полностью соответствуют описанию [2]. Однако при сравнении их с описанными ранее [2] обнаружены значительные различия в морфологии тела и внутренних органов, что привело к повторному описанию вида S. spasskii, так как типовые экземпляры [2] не сохранились. Обнаружение морфологически сходных с этим видом трематод у разных видов кефалевых рыб, пойманных в устьях разных рек Приморья, а также в географически удаленном регионе — заливе Тонкин (Вьетнам) поставило вопрос об их генетической идентичности, для решения которого нами впервые использованы некоторые маркеры ДНК.
Цель данного исследования — изучение генетического разнообразия трематод S. spasskii, которые инфицируют разные виды кефалевых рыб, обитающих на исследуемых территориях.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследовали 27 взрослых особей трематоды
Skrjabinolecithum spasskii, выделенных из пиленгасов (Liza haematocheila) и лобана (Mugilcephalus), отловленных в устьях разных рек Приморского края, а также из рыбы M. cephalus из Залива Тонкин около острова Кат Ба (Вьетнам, табл. 1). Материал фиксировали в 96%-ном этаноле. Тотальную ДНК экстрагировали с помощью метода щелочного лизиса [4].
Фрагмент гена 28S рРНК амплифицировали при помощи метода полимеразной цепной реакции и двух праймеров: прямого (DIGL2, 5'-AAG-CATATCACTAAGCGG-3') и обратного (1500R, 5'-GCTATCCTGAGGGAAACTTCG-3'). Оптимальная температура отжига для этой пары — 55°C [5].
Фрагмент рибосомной ДНК, включающий два внутренних транскрибируемых спейсера и ген 5.8S рРНК (ITS1-5.8S-ITS2) амплифицировали с использованием праймеров BD1 (5'-GTCGTAA-CAAGGTTTCCGTA-3') и BD2 (5'-TATGCT-TAAATTCAGCGGGT-3') при оптимальной температуре отжига 54°C [6]. Эффективность и спе-
цифичность ПЦР определяли при помощи позитивных и негативных контрольных проб соответственно.
Продукты ПЦР секвенировали, используя метод терминирующего синтеза и набор реактивов BigDyeTerminator Cycle Sequencing kit ("Life Technologies", США) на генетическом анализаторе GA 3130 (Биолого-почвенный институт ДВО РАН). Для секвенирования гена 28S рРНК использовали внутренние праймеры 300F, ECD2, 900F и 1200R [5], а также амплификационные праймеры. Для секвенирования фрагмента ITS1-5.8S-ITS2 использовали внутренние праймеры 3S [6] и праймер HaplRv2 (5'-CGTTCAAGATGTCGAT-3'), разработанный нами. Последовательности зарегистрированы в Европейской базе данных (European Nucleotide Archive, ENA, табл. 1).
Консенсусные последовательности выравнивали и анализировали, используя программы SeqS-capev.2.6 и MEGA 6.06 [7], определяли число вариабельных сайтов и оценивали степень диффе-ренцировки последовательностей (MEGA 6.06). Предковую последовательность определяли на основе алгоритма максимального правдоподобия на филогенетическом дереве в той же программе. Сети генотипов реконструировали в программе Arlequin 3.11 [8].
Филогенетические связи реконструировали при помощи алгоритмов максимального правдоподобия в программе MEGA 6.06 и алгоритма Байеса в программе MrBayesv.3.1.2 [9] с использованием модели обратимой эволюции (с коррекцией на гетерогенность позиций по скорости эволюции и с учетом доли инвариантных позиций [10]). Данная модель выбрана в качестве оптимальной в программе jModeltest 2 [11]. Алгоритм Байеса выполнял два параллельных анализа 10 млн генераций по четырем Марковским цепям. Для реконструкции консенсусного дерева отбрасывали деревья первого миллиона генераций. Статистическую значимость филогенетических связей оценивали при помощи бутстрэп-ме-тода [12] (для алгоритма максимального правдоподобия) и при помощи метода постериорных вероятностей (для алгоритма Байеса [9]).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В результате амплификации и секвенирования получены нуклеотидные последовательности участка гена 28S рРНК и фрагмента ITS1-5.8S-ITS2 рДНК исследуемой трематоды длиной 1047 и 1511 п.н. соответственно, которые сравнивали путем последующего выравнивания. Из них 1041 (99.4%) и 1494 (98.8%) оказались консервативными, а пять (0.5%) и 14 (0.9%) — филогенетически информативными для гена 28S рРНК и фрагмен-
Таблица 1. Список видов
трематод, использованных в работе (п — число образцов)
Вид n Окончательный Ссылки Регистрационный номер, GeneBank
хозяин 28S ITS1-5.8S-ITS2
Haploporoidea
Waretremadinae
зрачки, р. Раздольная, Приморский Край 4 Liza haematocheila Наши данные LK022754-LK022757 LK022759— LK022762
8. зрачки, Раздольная, Приморский Край 1 Mugil cephalus Наши данные LK022758 LK022763
8. зрачки, р. Киевка, Приморский Край 11 Liza haematocheila Наши данные HE806363-HE806376, LN614538-LN614539 HG530210-HG530219, LN614540-LN614541
8. зрачки, р. Карасик, Приморский Край 4 Liza haematocheila Наши данные HE806377-HE806380 HG530220-HG530223
8. зрачки, зал. Тонкин, о. Кат Ба, Вьетнам 7 Mugil cephalus Наши данные HG530224-HG530230 HG530203-HG530209
ШгвшщП тщ1Нео1т 1 Mugil cephalus [16] KC430096 -
ШгошщП а1аекыает1$ 1 Mugil cephalus [16] KC430095 -
8р1гИе$И$ Негуеуепз1з 1 Moolgarda seheli [16] KC206500 -
СарШтШа еоз(а(а 1 Selenotoca multifasciata [16] KC206497 -
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.