ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 11, с. 1454-1460
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^ ГЕНЕТИКА
УДК 575.86:579.8821
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПТИЧЬИХ ИЗОЛЯТОВ Chlamydophila psittaci
© 2007 г. С. П. Яцентшк, И. Л. Обухов
Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ "ВГНКИ"), Москва 123022; e-mail: pcr-lab@vgnki.ru
Поступила в редакцию 30.01.2007 г.
Пятьдесят один птичий изолят Chlamydophila psittaci был охарактеризован с использованием ре-стрикционного анализа omp1 гена. Подтверждено преобладание А-генотипа в изолятах C. psittaci от попугаев и выявлено наличие новых omp1 генотипов в изолятах C. psittaci от врановых. Выявлено отсутствие экстрахромосомной плазмиды в изолятах от врановых. Определены нуклеотидные последовательности omp1 и IGS рРНК участков новых изолятов. Филогенетический анализ показал, что выделенный от вороны изолят 1V по ряду признаков занимает промежуточное положение между C. abortus и C. psittaci. Полученные нами данные сопоставлены с результатами анализа филогенетических связей штаммов хламидий, полученными ранее.
Семейство Chlamydiaceae представляет собой группу облигатных внутриклеточных бактерий -хламидий, характеризующихся уникальным жизненным циклом и вызывающих ряд разнообразных по клиническому проявлению контагиозных болезней млекопитающих и птиц. Систематика Chlamydiaceae была кардинально пересмотрена в 1999 г. на основании данных о вариабельности ри-босомных генов представителей порядка Chlamy-diales [1]. Семейство Chlamydiaceae, которое ранее включало только один род Chlamydia, согласно новой классификации разделено на два рода: Chlamydia и Chlamydophila. В род Chlamydophila входят виды Chlamydophila psittaci (ранее -Chlamydia psittaci), Chlamydophila pneumoniae (ранее - Chlamydia pneumoniae) и Chlamydophila pe-corum (ранее - Chlamydia pecorum), а также Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae и Chlamydophila felis, которые выделены в самостоятельные виды из Chlamydia psittaci.
Chlamydophila psittaci, типовой вид рода Chlamydophila, является возбудителем орнитоза -заболевания, выявленного у более чем 170 видов птиц, а также представляющего опасность для млекопитающих и человека [2].
Известно, что, вызывая сходную клиническую картину, штаммы C. psittaci представляют собой весьма гетерогенную группу. Серовар-специфич-ные моноклональные антитела позволяют идентифицировать шесть (A-F) сероваров C. psittaci, пять из которых (A-E) являются широко распространенными, серовар F представлен единичным изолятом [3, 4]. Определенные серотипы C. psittaci (хотя и не строго) поражают определенные
виды птиц. Так, серотип А преимущественно выявляли в пробах от попугаев, В - от индюков, длиннохвостых попугаев и уток; C - от уток, индюков, куропаток; D - индюков, чаек, волнистых попугайчиков и человека; E - от голубей и уток [5].
Использование молекулярно-биологических методов позволило выявлять несколько (A-F) вариантов C. psittaci, идентифицируемых секвени-рованием или ПДРФ-анализом omp1 гена [6]. Так, в работе Vanrompay с соавт. [7] ДНК-паттерны A,
B, D и E, полученные в результате рестрикции omp1 ампликонов рестриктазой AluI, на 98% соответствовали сероварам A, B, C и D C. psittaci соответственно. Дальнейшие исследования показали, что результаты генотипирования не всегда полностью коррелируют с данными серотипирова-ния [4, 5]. При проведении анализа генов 16S РНК, omp1 и rnpB выявлены штаммы C. psittaci, занимающие промежуточное положение между
C. psittaci и С. abortus [8].
Штаммы C. psittaci, циркулирующие среди птиц в России (в отличие от европейских стран), не охарактеризованы. В последние годы значительно увеличился ввоз в Россию экзотических птиц нелегальным путем, что может привести к повышению заболеваемости орнитозом человека, дикой и синантропной орнитофауны, а также к появлению в России новых штаммов C. psittaci.
Целью данной работы являлось изучение мо-лекулярно-генетических характеристик птичьих изолятов C. psittaci, выделенных в Москве в 20052006 гг.
Таблица 1. Условия ПЦР и праймеры, использованные в работе
Участок ДНК Праймер Условия ПЦР
ompA [9] CTU: 5'-atgaaaaaactcttgaaatcgg-3' 1 цикл: 3 мин - 94°С
CTL: 5'-caagattttctaga(c/t)ttcat(c/t)ttgtt-3' 40 циклов: 20 с - 94°С
20 с - 50°С
20 с - 72°С
1 цикл: 3 мин - 72°С
IGS рРНК [10] cIGS1F: 5'-caaggtgaggctgatgac-3' 1 цикл: 3 мин - 94°С
cIGS2R: 5'-tcgcct(g/t)tcaatgccaag-3' 42 цикла: 20 с - 94°С
15 с - 46°С
15 с - 72°С
1 цикл: 3 мин - 72°С
Плазмидная ДНК [8] ML-PLF01: 5'-cagaacggtgtgtagatt-3' 1 цикл: 3 мин - 94°С
ML-PLR01: 5'-aggagataaggttgctaa-3' 42 цикла: 20 с - 94°С
15 с - 50°С
15 с - 72°С
1 цикл: 3 мин - 72°С
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали патологический материал - помет и паренхиматозные органы птиц, поступавших с подозрением на орнитоз в Центр молекулярной диагностики ФГУ ВГНКИ в период с сентября 2005 г. по октябрь 2006 г.
Выделение ДНК проводили методом сорбции на силикагеле с использованием набора "ДНК-сорб" (ЦНИИЭ).
Для амплификации гена отр1 были использованы праймеры СТи и СТЪ [9], соответствующие консервативным участкам гена.
ПЦР проводили на амплификаторе ТЕРЦИК ("ДНК-технология"). Состав реакционной смеси: 66 мМ трис-НС1, рН 8.3, 16.7 мМ (Ш^04, 0.05 мг/мл БСА, 0.01% твин-20, 8%-ный глицерин, 3.5 мМ Mga2, 0.2 мМ dNTPs, по 0.4 мкМ праймеров, 2.5 ед. Taq ДНК-полимеразы.
Продукты реакции амплификации после дополнительной очистки использовали для проведения ПДРФ-анализа.
ДНК рестрицировали ферментом А1и1 (Сибэн-зим) по стандартной методике.
Рестрикционные паттерны визуализировали методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий.
Для амплификации 16S-23S межгенного спей-сера рРНК использовали праймеры IGS1F и IGS2R [10]. Амплификацию ORF8-ORF1 участка плазмиды хламидий осуществляли с использованием праймеров ML-PLF01 и ML-PLR01 [8]. Последовательность праймеров и условия амплификации представлены в табл. 1.
ПЦР-фрагменты секвенировали с использованием набора ABI PRISM® Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction. Продукты реакции анализировали с помощью ABI 310 Genetic Analyser ("Perkin Elmer").
Полученные нуклеотидные последовательности выравнивали с последовательностями представителей Chlamydiaceae, размещенными в базе данных GenBank, с использованием программы ClustalX. Для построения филогенетических деревьев применяли метод ближайшего связывания (neighbor-joining, NJ) [11] с использованием р-рас-стояний (без коррекции на повторные мутации) и расстояния Кимуры согласно двухпараметриче-ской модели фиксации нуклеотидных замен из пакета программ MEGA2 [12]. Значимость реконструкций оценивали методом бутстрепа с использованием 500 репликаций.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Вариабельность ompl участка изолятов C. psittaci
Проанализирован 51 изолят C. psittaci, выделенных в период с сентября 2005 г. по октябрь 2006 г., из них 3.9% (2 образца) - взяты от представителей Columbiformes (голуби), 5.88% - от представителей отряда Passeriformes сем. Corvidae (врановые) - 2 образца от ворон (Corvus cornix), 1 образец - от грача (Corvus frugilegus). Остальные пробы (90.22%) исследованы от представителей разных видов отряда Psittaciformes (попугаи).
Размер амплифицированного omp1 фрагмента составил 1050 пн.
M 12 3
Рис. 1. Рестрикционные профили изолятов C. psittaci. M - маркер молекулярных масс ДНК (фрагменты 100, 200, 300, 400, 500, 800 пн), 1 - изолят 6N C. psittaci, выделенный от грача, 2 - изолят 1V C. psittaci, выделенный от вороны, 3 - изолят C. psittaci, выделенный от попугая (А-генотип).
По результатам анализа рестрикционных omp1-Alul профилей 48 образцов были отнесены к A-генотипу.
Генотипы В, C, D, F, E/B и G в нашем исследовании обнаружены не были. Полученные резуль-
таты подтверждают данные других исследователей о преобладании генотипа А среди птичьих изолятов C. psittaci [4, 6, 7].
Кроме того, в трех образцах, взятых от врановых, обнаружены рестрикционные профили C. psittaci, отличающиеся от ранее описанных [4, 7]. На рис. 1 представлены рестрикционные профили образца 6N, выделенного от грача, и образца 1V C. psittaci, выделенного от вороны.
Нуклеотидные последовательности участка omp1 гена изолятов 9N и 1V, выделенных от ворон, и изолята 6N C. psittaci, выделенного от грача, были секвенированы. Длина секвенированных последовательностей 1V и 6N составила 868 пн. Длина 9N составила 601 пн. Изолят 9N был на 95% гомологичен штаммам TT3 и NJ1, выделенным от индеек и относящимся к D-генотипу [5]. При сравнении полученных omp1 нуклеотидных последовательностей изолятов с нуклеотидными последовательностями этого участка ДНК штаммов C. caviae, C. psittaci, C. abortus, C. felis, C. pe-corum и C. pneumoniae проанализированы 42 последовательности. Длина выравнивания составила 738 пн. Анализируемый участок ompl гена включает 4 высоковариабельные области (VD I-VD IV) и расположенные между ними консервативные сегменты CS2, CS3, CS4 [13].
Уровень гомологии последовательностей ompl гена различных штаммов C. psittaci составляет 8290%. Изолят 6N, выделенный от грача, оказался наиболее гомологичен штаммам TT3 и NJ1, однако уровень гомологии по сравнению с 9N был значительно ниже и составил 88%. Нуклеотидная последовательность ompl гена 1V изолята значи-
Таблица 2. Отличия отр1 участка IV изолята по сравнению с аналогичными последовательностями других штаммов хламидий
Характеристика последовательности Штаммы C. psittaci Штамм C. abortus
Нуклеотидные различия 6 BC 84/2334 VS225 R54 6N Par1 B577
CS2 32 13 12 8 22 17 10
CS3 19 11 15 7 24 11 13
CS4 15 16 11 14 23 14 13
Всего 66 40 38 29 69 42 36
Аминокислотные различия
CS2 2 1 1 1 2 2 1
CS3 2 1 2 0 3 0 1
CS4 2 3 4 3 7 3 4
Всего 6 5 7 4 12 5 6
Делеции/инсерции в VD-областях* 4 1 1 1 1 1 2
в CS-областях* Делеция двух аминокислот в CS-3 области 1V изолята
* По аминокислотной последовательности.
66
100
76
63
78
83
71
100
100
86
100
100
57
100
60
100
58
94
57
100L
ТШ1
81
L_|-
10
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.