= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ :
УДК 575.113:575.174.015.3:575.232.3
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ ЗЛССИЛЮМУСЕБ СЕЯЕУШЛЕ © 2013 г. Е. С. Наумова*, А. Ж. Садыкова*, Н. Н. Мартыненко**, Г. И. Наумов*, 1
* Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции
промышленных микроорганизмов, Москва ** Московский государственный университет пищевых производств, Москва
С помощью ПЦР-ПДРФ-анализа 5.8S-ITS участков рДНК, молекулярного кариотипирования и Са-узерн-гибридизации изучены особенности геномов 36 спиртовых штаммов Saccharomyces, в основном отечественного происхождения. Молекулярным анализом установлено, что все штаммы относятся к виду S. cerevisiae. Согласно кариотипическому анализу многие штаммы являются анеуплоидными. Обнаружено накопление полимерных генов SUC и MAL у отечественных спиртовых штаммов S. cerevisiae. Накопление полимерных генов ферментации сахаров может иметь адаптивное значение и приводить к увеличению ферментационной активности штаммов. Показано, что большинство штаммов, сбраживающих мальтозу через 1 сутки, обладают несколькими генами MAL. Отобраны термоустойчивые штаммы, обладающие хорошей ферментационной активностью.
Ключевые слова: спиртовые дрожжи Saccharomyces cerevisiae, ПЦР-ПДРФ-анализ 5.8S-ITS фрагмента рДНК, молекулярное кариотипирование, Саузерн-гибридизация, гены SUC, MAL и MEL, термоустойчивость.
DOI: 10.7868/S0026365613020110
Этиловый спирт широко используется в химической, фармакологической и пищевой промышленности, а в последние годы также находит все большее применение в качестве биотоплива. В основе биотехнологического получения этанола из крахмалсодержащего сырья (рожь, пшеница, картофель, кукуруза) и отходов сахарного производства (мелассы) лежит процесс брожения с использованием традиционных спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Основным дисахари-дом при гидролизе крахмала является мальтоза, а основным компонентом мелассы — сахароза (до 54—63%). Кроме того, в состав мелассы входит трисахарид раффиноза, для полного гидролиза которого необходимо наличие у дрожжей двух ферментов: бета-фруктозидазы и альфа-галакто-зидазы. Поэтому для спиртовых дрожжей важным признаком является способность сбраживать мальтозу, сахарозу и мелибиозу.
Алкогольная ферментация дрожжами Saccharomyces мальтозы, сахарозы и мелибиозы контролируется, соответственно, полимерными генами MAL, SUC и MEL, которые расположены в тело-мерных областях различных хромосом и могут накапливаться в определенных штаммах [1—7].
1 Автор для корреспонденции (e-mail: gnaumov@yahoo.com).
Ферментация мальтозы у дрожжей S. cerevisiae детерминируется пятью локусами — MAL1—MAL4 и MAL6, каждый из которых состоит из трех тесно сцепленных генов, кодирующих мальтозную пер-меазу (GENE1), мальтазу (GENE2) и регулятор-ный транскрипционный активатор (GENE3) [8]. Для ферментации мальтозы необходимо наличие всех трех генов в любом локусе. Семейство генов SUC представлено девятью генами SUC1—SUC5, SUC7, SUC8—SUC10, которые, за исключением SUC2, расположены в теломерных областях [1, 9— 12]. Ферментация мелибиозы — очень редкий признак у дрожжей S. cerevisiae. Большинство штаммов не сбраживают мелибиозу и даже не обладают молчащей последовательностью гена MEL. У штаммов S. cerevisiae, обитающих в желудочно-кишечном тракте млекопитающих и отходах производства оливкового масла обнаружено накопление генов MEL [3]. В разных комбинациях у дрожжей S. cerevisiae идентифицировано 11 структурных генов MEL1—MEL11 [13].
Современная технология производства спирта — многоэтапный процесс, включающий процессы сахарификации измельченного биологического сырья рекомбинатными грибными ферментами при 45—50°C и последующей микробиологической ферментации сахаристого раствора дрожжами-са-
харомицетами при оптимальной для их роста температуре (28—30°C) [14—16]. Объединение процессов сахарификации и ферментации позволяет избежать подогревания/охлаждения промышленных емкостей и способствует более эффективной работе гидролитических ферментов, которые в этом случае не подвергаются ингибированию конечными продуктами гидролиза — моно- и дисахаридами, конвертируемыми непосредственно в спирт дрожжами S. cerevisiae.
Согласно современной классификации, род Saccharomyces включает S. cerevisiae и его шесть видов-двойников: S. arboricola, S. bayanus, S. cari-ocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae и S. paradoxus [17—20]. Фенотипически неразличимые виды Saccharomyces можно дифференцировать по нук-леотидным последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1/ITS2 и по молекулярным кариотипам [17, 21—23].
В данной работе проведено молекулярно-ге-нетическое изучение спиртовых дрожжей Saccharomyces различного происхождения. Отобраны штаммы, обладающие хорошей ферментационной способностью и устойчивые к повышенным температурам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и среды. Использованные в работе штаммы представлены в таблице. Дрожжи выращивали при 28°С на полной среде YPD (г/л): ба-кто-агар фирмы "Difco" (США) — 20; глюкоза фирмы "Merck" (Германия) — 20; дрожжевой экстракт "Difco" — 10; бакто-пептон "Difco" — 20. В качестве контролей привлекали видовые тестеры дрожжей S. cerevisiae ВКМ Y-502, S. arboricola CBS 10644, S. bayanus ВКМ Y-1146, S. cariocanus UFRJ 50816, S. kudriavzevii NBRC 1802, S. mikatae NBRC 1815 и S. paradoxus CBS 432.
Способность дрожжей сбраживать различные сахара (мальтозу, сахарозу и мелибиозу) определяли по выделению углекислого газа в жидкой среде YP в бродильных пробирках с поплавками. Состав ферментационной среды YP тот же, что и среды YPD, но без агара, а вместо глюкозы использовали, соответственно, 2% мальтозу, сахарозу или мелибиозу. Штаммы фенотипа Suc+, Mal+ и Mel+ сбраживают соответствующие сахара в указанной концентрации обычно через 1 сутки и в редких случаях через 2—3 суток. Дрожжи Suc-, Mal- и Mel- не сбраживают указанные сахара через 10 суток.
Скорость сбраживания сахаров определяли по количеству выделяемого углекислого газа. Опыты проводили в двух повторностях. В пробирки с 5 мл YP среды засевали дрожжами в конечной концентрации 106 клеток в мл и инкубировали в течение 48 ч при 28°С. Затем инокулят (5 мл) переносили
в колбы со 100 мл стерильной среды YP, содержащей 20 г/л глюкозы. Ферментацию проводили при 28°С в течение 72 ч. Через каждые 24 ч колбы взвешивали и определяли количество выделившегося углекислого газа (СО2) за счет изменения веса колб. В качестве контроля использовали колбы со 100 мл YP среды без инокулята.
ПЦР-анализ. Амплификацию гена 5.8S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 (5.8S-ITS-фрагмент) осуществляли с праймерами pITSl (5'-TCCGTAGGTGAACCT-GCGG-3') и pITS4 (5'-CCTCCGCTTATTGATAT-GC-3'). Для амплификации генов MELI, SUC2 и MAL62 использовали следующие пары прайме-ров: DM1/DM2: TTCGCAGATGGGTTGGGA-CAA и TAAGCTTGCTGGAACAGTTGTGTT, SD1/SR: ATGCTTTTGCAAGCTTTC и GGTCAT-GTTCACAGATCC, MAL62F/MAL62R: ATAAC-GATGGCTGGGGTGATT и MAL62R,AAAGCAG-CAAACAGCGTCTT.
ПЦР осуществляли на ДНК-амплификаторе "Терцик" ("ДНК-технология", Россия) непосредственно на дрожжевых клетках. Небольшое количество биомассы дрожжей (на кончике микробиологической петли) суспендировали в 30 мкл буфера, содержащего 3 мМ MgCl2, 0.3 мМ дНТФ, 50 пмоль каждого из праймеров. Полученную смесь выдерживали при 95°С в течение 15 мин для лизиса клеток, затем добавляли 2.5 единицы 7й#-полимеразы ("Синтол", Россия). Продукты амплификации подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле при 60—65В в 0.5х TBE буфере (45 мМ трис, 10 мМ ЭДТА, 45 мМ борная кислота) в течение 1.5 ч и окрашивали бромистым этидием.
Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) 5.8S-ITS фрагментов осуществляли с помощью эндонуклеаз HpaII и HaeIII ("Fermentas", Литва). Разделение фрагментов рестрикции проводили в 2.5%-ном агарозном геле при 50—55 В в 0.5х ТВЕ буфере в течение 4 ч. Гель окрашивали бромистым этидием в течение 2—3 ч, затем промывали в дистиллированной воде и фотографировали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Vilber Lour-mat (Франция).
Молекулярное кариотипирование и Саузерн-ги-бридизация. Препараты хромосомных ДНК приготовляли согласно [24]. Электрофоретическое разделение хромосомных ДНК проводили на аппарате CHEF-DR III фирмы "Bio-Rad" (США) при 200 В в следующем режиме: 15 ч при времени переключения полей 60 с и 8 ч при времени переключения полей 90 с. В качестве буфера использовали 0.5х TBE (45 мМ трис, 45 мМ борная кислота, 10 мМ ЭДТА, рН 8.2), охлажденный до 14°С. Штамм YNN 295 (Bio-Rad), имеющий известный порядок и размеры хромосом, служил кариоти-
Характеристика изученных штаммов дрожжей Saccharomyces
Видовое название, штамм Источник и место выделения Ферментация сахаров*
Mal Suc Mel
Saccharomyces arboricola
CBS 10644 Кора дуба, Китай - + +
Saccharomyces bayanus
ВКМ Y-1146 Виноград, Россия + + +
Saccharomyces cariocanus
UFRJ 50816 Бго8орЫ1а sp., Бразилия - + -
Saccharomyces kudriavzevii
NBRC 1802 Гниющий лист, Япония - + -
Saccharomyces mikatae
NBRC 1815 Почва, Япония - + +
Saccharomyces paradoxus
CBS 432 Неизвестно - + -
Saccharomyces cerevisiae
X2180-1A Гаплоидная генетическая линия - +2 -
ВКМ Y-1830 Виноград, Мичуринск +1 +1 -
C.B.11 Дериват штамма МСУС 74 - - +1
№ 1 Сухие дрожжи, Китай + 1 + 1 + 1
№ 2 Сухие дрожжи, Китай + 1 + 1 + 1
№ 4 Сухие дрожжи, Австрия +2 +2 +1
№ 5 Сухие дрожжи, Китай +2 +1 +1
№ 6 Сухие дрожжи, Китай +2 +2 +1
ВКПМ Y-187 Почва, спиртовые дрожжи, УкрНИИСБПП +1 +2 -
ВКПМ Y-408 Спиртовые дрожжи, ГНУ ВНИИПБТ Россельхозакадемии +1 +1 -
ВКПМ Y-480 Спиртовые дрожжи, Институт микробиологии и вирусологии, Латвия +1 +2 -
ВКПМ Y-563 Спиртовые дрожжи, УКРНИИСП +2 +1 +1
ВКПМ Y-564 Спиртовые дрожжи, УКРНИИСП +1 +2 +2
ВКПМ Y-622 Спиртовые дрожжи, Институт микробиологии и вирусологии, Латвия +1 +2 -
ВКПМ Y-626 Спиртовые дрожжи +2 +2 -
ВКПМ Y-1330 Спиртовые дрожжи +1 +1 -
ВКПМ Y-318 Спиртовые дрожжи, КТИПП +1 +2 -
ВКПМ Y-1334 Спиртовые дрожжи +2 +1 -
ВКПМ Y-1693 Спиртовые дрожжи, Кот
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.