МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 5, с. 626-628
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.68
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОЦИСТИН-ПРОДУЦИРУЮЩИХ ТАКСОНОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ В ОЗЕРЕ НЕРО (РОССИЯ) © 2014 г. С. И. Сиделев
Ярославский государственный университет имени П.Г. Демидова Поступила в редакцию 06.03.2014 г.
БО1: 10.7868/80026365614050243
Микроцистины — это природные гепатотокси-ны, продуцируемые разными таксонами ци-анобактерий, наиболее часто видами из родов Microcystis, Anabaena и Planktothrix [1]. В связи с их опасностью для человека во многих странах мира по рекомендации Всемирной Организации Здравоохранения контролируется присутствие циано-токсинов в питьевой воде и в рекреационных зонах водоемов [2]. В Российской Федерации отсутствуют нормативы допустимого уровня содержания микроцистинов в питьевой и природной водах. Для разработки системы мониторинга необходимы исследования по выявлению наиболее распространенных в водоемах нашей страны таксонов цианобактерий, способных синтезировать микроцистины. Массовое развитие цианобакте-рий не всегда сопровождается продуцированием токсинов, поскольку в воде могут доминировать нетоксигенные популяции, морфологически не отличимые от токсигенных. Определение и секвени-рование кластера генов mcy, ответственного за биосинтез микроцистинов [3], дало начало "молекулярной эре" в исследованиях цианотоксинов. Появилась возможность с использованием молеку-лярно-биологического подхода выявлять наличие токсигенных цианобактерий в воде задолго до того, как содержание микроцистинов превысит предельно допустимый уровень. Применение данных методов в программе мониторинга целесообразно лишь в том случае, если микроскопический анализ выявит присутствие в водоеме потенциально токсичных таксонов цианобактерий. Однако данные об основных продуцентах цианотоксинов в водоемах России единичны и получены с использованием трудоемких методик (клонирование и секвени-рование ДНК, филогенетический анализ), не адаптированных для целей рутинного экологического мониторинга [4].
Цель данной работы — молекулярно-генетиче-ская идентификация таксономической принадлежности микроцистин-продуцирующих ци-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: Sidelev@mail.ru).
анобактерий непосредственно в природных пробах на примере самого крупного в Ярославской области озера Неро.
Пробы воды из озера Неро были отобраны в июле-сентябре 2009—2011 гг. Идентификацию видов цианобактерий осуществляли с использованием соответствующих определителей [5—7], биомассу цианобактерий в пробе определяли в камере Нажотта счетно-объемным методом. Выделение ДНК из концентрированных на фильтрах образцов осуществляли набором реагентов Metagenomic DNA Isolation Kit for Water ("Epicentre"). Амплификацию специфического участка гена синтеза микроцистинов mcyA проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием mcyA-Cd праймеров в соответствии с условиями, описанными в работе [1]. Полученные ампликоны анализировали с использованием метода полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP-анализ), разработанного для определения таксономической принадлежности микроцистин-синтезирующих цианобактерий М. Хизбергуесом и соавторами [1]. Очищенные набором GeneJET PCR Purification Kit ("Thermo Scientific") ПЦР-продукты из природных проб со смешанным составом цианобактерий обрабатывали как по отдельности, так и одновременно двумя рестриктазами EcoRV и HindIII ("Fermentas"). Полученные рестрикционные профили сравнивали с таковыми контрольных цианобактериаль-ных штаммов. В качестве контролей использовались ДНК аксеничных культур цианобактерий Microcystis aeruginosa (штамм PCC 7806) и Planktothrix agardhii (штамм NIVA-CYA 126), продуцирующих микроцистины (предоставлены Элькой Диттманн, Университет Потсдама). Поскольку контрольный штамм Anabaena отсутствовал, для определения потенциальных видов-продуцентов микроцистинов данного рода использовали теоретические длины рестрикционных фрагментов участка гена mcyA-Cd, характерные для Anabaena, согласно статье [1]. Дополнительно для подтвер-
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ
627
ждения результатов рестрикционного анализа ДНК фитопланктона из тех же проб амплифици-ровали с помощью родоспецифичных праймеров mcyE-F2/AnamcyE-2R, позволяющих идентифицировать присутствие участка гена микроцистин-синтетаз mcyE анабен [8]. Рестрикционные фрагменты фракционировали электрофоретически в 3% агарозном геле и анализировали в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием. В качестве внешнего стандарта молекулярных масс использовали O'GeneRuler Low Range DNA Ladder ("Thermo Scientific").
Во всех проанализированных пробах был обнаружен участок гена синтеза микроцистинов mcyA (размером 297 п.н.), что подтвердило присутствие гепатотоксичных цианобактерий в озере Неро. Микроскопический анализ выявил одновременное присутствие во всех пробах потенциально токсигенных родов Microcystis и Anabaena, а также Planktothrix agardhii Gom. (рисунок, г). Среди Microcystis по биомассе доминировали M. aeruginosa и M. wesenbergii Kom., спорадически также встречались M. flos-aquae (Wittr.) Kirchn., M. novacekii (Kom.) Comp., M. viridis (A. Br.) Lemm. и M. smithii Kom. et Anagn. Среди Anabaena преобладали следующие виды: A spiroides Kleb., A. sphaerica f. conoidea Elenk., A. sigmoidea Nyg., A. viguieri Denis et Fremy, A. flos-aquae (Lyngb.) Breb. и A. circinalis (Kutz.) Hansg. В 2009—2010 гг. все 3 токсигенных рода ци-анобактерий были представлены в фитопланктоне количественно в примерно равном соотношении (рисунок, г), в 2011 г. P. agardhii в пробах отмечался лишь в виде отдельных нитей, биомасса была крайне низкой (не более 0.1 мг/л), доминировали виды родов Microcystis (до 94 мг/л) и Anabaena (до 34 мг/л) (рисунок, г). RFLP-анализ показал, что основными продуцентами гепатоток-синов микроцистинов в озере Неро являются виды рода Microcystis, поскольку для всех проб полученные рестрикционные профили оказались идентичны профилю рестрикции M. aeruginosa PCC 7806 (для HindIII - 2 фрагмента длиной 191 и 100 п.н., для Eco RV — 2 фрагмента длиной 232 и 59 п.н., для HindIII + Eco RV — 3 фрагмента длиной 191, 59 и 41 п.н.) (рисунок, а, б, в). Кроме того, в пробах 2009—2010 гг. выявлено присутствие
Рестрикционный анализ ампликонов mcyA-Cd, обработанных рестриктазами HindIII (а), EcoRV (б), HindIII + EcoRV (в) и изменение биомассы потенциально токсигенных цианобактерий в озере Неро (2009—2011 гг.) (г). Дорожки: М — маркер молекулярного веса (п.н.), Pl.ag — профиль рестрикции ампликона mcyA-Cd (штамм Planktothrix agardhii NIVA-CYA 126), M.aer. — профиль рестрикции ампликона mcyA-Cd (штамм Microcystis aeruginosa PCC 7806), 1—6 — профили рестрикции ампликонов mcyA-Cd из природных проб озера Неро (1 — VII 2009; 2 - VIII 2009; 3 - IX 2009; 4 - VIII 2010; 5 -VII 2011; 6 - VIII 2011), * - звездочками обозначены плохо различимые на рисунке фрагменты ампликонов.
(a)
M Pl.ag M.aer 1 2 3 4 5 6
700 - — Er^j
300 - * Ш
100 -
50 - о * * * * * * *
25 - HindIII
(б)
M Pl.ag M.aer 1 2 3 4 5 6
700 - wSf ■ . ■••
300 - * —
100 - m-
50 - *0D * * * * * *
25 - EcoRV
(в)
M Pl.ag M.aer 1 2 3 4 5 6
700 300
100 50 25
f
* *
* . *
HindIII + EcoRV
(г)
95 г
93 35
п
св о о св
о
S —
к
I
VII 2009 IX 2009 VII 2011
VIII 2009 VIII 2010 VIII 2011
I I Mycrocystis sppH Anabaena spp.^jl Planktothrix agardhii
*
0
МИКРОБИОЛОГИЯ том 83 № 5 2014
628
СИДЕЛЕВ
микроцистин-продуцирующих популяций ци-анобактерии P. agardhii, длины рестрикционных фрагментов ПЦР-продуктов совпали в этих пробах (дорожки 1—4) с таковыми у контрольного штамма P. agardhii NIVA-CYA 126 (для HindIII — 2 фрагмента размером 261 и 36 п.н., для EcoRV — 1 фрагмент размером 297 п.н., для HindIII + Eco RV — 2 фрагмента размером 261 и 36 п.н.) (рисунок, а, б, в). В 2011 г. (дорожки 5-6) обнаружить присутствие токсигенных популяций P. agardhii в оз. Неро оказалось затруднительным (рисунок, а, б, в), по-видимому, из-за крайне низкого обилия данного вида и значительного преобладания Microcystis и Anabaena (рисунок, г). Это первое сообщение об обнаружении гепатотоксичных популяций P. agardhii на территории России, ранее штаммы данного вида, способные продуцировать микро-цистины, в водоемах нашей страны обнаружить не удавалось [9]. Фрагменты участка гена mcyA-Cd, характерные для микроцистин-синтезирую-щих представителей рода Anabaena [1], в озере Неро не выявлены. Кроме того, при амплификации суммарной ДНК фитопланктона из тех же проб с праймерами mcyE-F2/AnamcyE-2R ПЦР-продукты не были обнаружены, что подтвердило результаты RFLP-анализа.
Таким образом, впервые в фитопланктоне оз. Неро обнаружено сосуществование гепатотоксичных популяций видов рода Microcystis и P. agardhii, представители рода Anabaena не способны продуцировать микроцистины. Проведена успешная апробация простых молекулярных подходов к идентификации таксономической принадлежности цианобактерий, синтезирующих микроцистины, непосредственно в природных пробах, что подтверждает возможность использования данных методов в мониторинге цианобак-териальных токсинов.
Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ № МК-1284.2013.5, проекта Немецко-Российского междисциплинарного научного центра (G-RISC) № С-2012а-10, гранта РФФИ № 1204-31280 и проекта Минобрнауки РФ 4.4532.2011.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hisbergues M., Christiansen G., Rouhiainen L., Sivonen K., Börner T. PCR-based identification of mi-crocystin-producing genotypes of different cyanobacte-rial genera // Arch. Microbiol. 2003. V. 180. P. 402-410.
2. Falconer I.R., Humpage A.R. Health risk assessment of cyanobacterial (blue-green algal) toxins in drinking water // Int. J. Environ. Res. Public Health. 2005. № 2. Р. 43-50.
3. TillettD., Dittmann E., ErhardM., von Döhren H., Börner T., Neilan B.A. Structural organization of microcys-tin biosynthesis in Microcystis aeruginosa PCC 7806: an integrated peptide-polyketide synthase system // Chem. Biol. 2000. № 7. Р. 753-764.
4. Belykh O.I., Dmitrieva O.A., Gladkik
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.