ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 8, с. 1108-1116
ГЕНЕТИКА ^^^^^^^^^^^^^^ ЖИВОТНЫХ
УДК 575.22:599.322.2
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВЯЗИ НЕКОТОРЫХ ВОСТОЧНО-ПАЛЕАРКТИЧЕСКИХ ВИДОВ СУСЛИКОВ РОДА
Spermophilus (Sciuridae, Rodentia)
© 2008 г. М. В. Цвирка, Л. Н. Спиридонова, В. П. Кораблев
Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук, Владивосток 690022; e-mail: tsvirka@ibss.dvo.ru Поступила в редакцию 09.01.2007 г.
Окончательный вариант получен 10.04.2007 г.
Методом RAPD-PCR с десятью произвольными праймерами исследовано генетическое разнообразие четырех видов восточно-палеарктических сусликов рода Spermophilus: S. undulatus, S. parryi (подрод Urocitellus), S. dauricus и S. relictus (подрод Citellus). В качестве внешней группы использовали азиатского бурундука Tamias sibiricus. Выявлены молекулярные маркеры разного таксономического уровня: родов Spermophilus и Tamias, подродов Urocitellus и Citellus, каждого из четырех видов - S. undulatus, S. parryi, S. dauricus и S. relictus. Для исследованных видов и подродов сусликов рассчитаны показатели генетической дифференциации (Ht, Hs, Dst, Gst, Nm, D) и построены NJ-филогенетическая реконструкция и UPGMA-дендрограммы генетического сходства особей и объединенных популяций. Результаты сравнительного молекулярно-генетического анализа показали высокий уровень генетической дифференциации видов S. undulatus, S. dauricus, S. relictus, S. parryi между собой (Gst = 0.58-0.82, D = 0.53-1.06) и низкий уровень генетической дифференциации подродов Citellus и Urocitellus (Gst = 0.33, D = 0.27), выделяемых в соответствии с существующими таксономическими системами рода Spermophilus.
Суслики рода БрвтторНИш широко распространены в Голарктике: в Евразии - от Австрии до российского Дальнего Востока, в Северной Америке - от Аляски до Мексики. Они занимают разнообразные биотопы: пустыни, степи, тундры и лесистые местности. К настоящему времени род включает 38 признанных видов, 14 из которых распространены в Евразии [1-4]. Суслики являются объектами многих областей биологии [1, 5, 6] и хорошо изучены разными генетическими методами [7-10]. Несмотря на разностороннюю изученность, таксономия рода БрвтторНИш остается той областью, в которой до сих пор продолжаются активные исследования.
В крупных научно-исследовательских работах, посвященных исследованию млекопитающих, особое внимание уделено влиянию географических факторов на генетическую дифференциацию разных видов грызунов [2, 3]. Строгая привязанность генетической дифференциации таксонов к западной и восточной частям Пале-арктики показана и для рода ЗрвтторНИш [10]. Ранее нами были исследованы западные (подрод С1-1в11ш) и центрально-палеарктические (подрод Со1оЪой8) виды сусликов и показаны особенности их формообразования в связи с географическим распространением [11-14]. Следуя выбранному ранее направлению исследований, в настоящей работе мы изучили генетическое разнообразие и реконструировали филогенетические связи группы близких аллопатрических и семисимпатрических
видов сусликов, распространенных в восточной части Палеарктики: S. undulatus Pallas, 1778; S. parryi Richardson, 1825; S. relictus Kaschkarov, 1923; S. dauricus Brandt, 1843.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследованы образцы тканей сусликов рода Spermophilus: S. undulatus и S. parryi (подрод Uroc-itellus), S. dauricus и S. relictus (Citellus). Таксономическая интерпретация дана согласно классификации Громова с соавт. [1]. В качестве внешней группы использовали азиатского бурундука Tamias sibiricus Laxmann, 1769. В общей сложности изучено 38 особей сусликов из 11 географических точек России и Узбекистана и три особи бурундуков (рис. 1). Общая характеристика материала представлена в табл. 1.
ДНК получали стандартным фенольно-де-тергентным способом из свежих и фиксированных в этаноле тканей [15], с использованием протеиназы К.
Для выявления высокополиморфных продуктов амплификации мы провели предварительное тестирование 26 декамерных олигонуклеотидных праймеров со случайной структурой. Только 10 из них синтезировали хорошо различимые и воспроизводимые продукты амплификации и были использованы в постановке экспериментов: OPA-02, OPC-02, OPC-05, OPC-09, OPC-10, OPC-12, OPC-16,
-тт-
\ ; 11
■ S. parryi
Магадан 'у
Якутск
• 10 S. relictus '
Новосибирск /О
оз. Байкал/ 4, 5
V
S. undu
atus
6 Хабаровск i
а2
Рис. 1. Места сбора материала (цифры соответствуют номерам мест сбора в табл. 1).
OPC-20, OPD-05, OPE-20 ("Operon Technologies Inc.", США) (табл. 2).
Полимеразную цепную реакцию (RAPD-PCR) проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 60 нг тотальной ДНК, 1х буфер (67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 2 мМ MgCl2, 0.1% твин-20, 0.01 М 2-мер-каптоэтанола), по 0.2 мМ каждого dNTP, 0.5 мкл праймера, 1ед. Гад-полимеразы, в следующих условиях: денатурация - 2 мин/940C, затем
41 цикл: денатурация - 1 мин/940C, отжиг -30 с/37°С, 15 с/45°^ синтез - 2 мин/72°С Стадию синтеза на конечном этапе проводили при 72°С в течение 6 мин. RAPD-PCR-продукты анализировали с помощью электрофореза в 2%-ном агароз-ном геле, содержащем 0.5 мкг/мл бромистого этидия в 1х TBE-буфере, и фотографировали в УФ-свете. В качестве маркера молекулярной массы использовали РМ-гидролизат ДНК фага
Таблица 1. Характеристика материала, использованного в исследовании
Номер места сбора Вид Число особей (n) Место сбора
1 Spermophilus dauricus dauricus 3 РФ, Читинская обл., Ононский р-н, окр. п. Усть-Ималка
2 То же 6 Там же, окр. п. Усть-Ималка, кордон "Булум"
3 » 4 Там же, окр. п. Усть-Ималка, стационар "Бельджанино"
4 S. undulatus undulatus 4 Там же, с. Верхний Цасучей (долина р. Онон)
5 То же 1 Там же, Читинский р-н, станция "Новая" (60 км на восток от Читы)
6 S. u. menzbiery 6 РФ, Амурская обл., Михайловский р-н, окр. с. Безозерное
7 S. u. jacutensis 6 РФ, Якутия, п. Тулагино (22 км от Якутска)
8 S. u. eversmanni 1 РФ, Республика Алтай, п. Онгудай
9 То же 1 Там же, п. Каракоп
10 S. relictus relictus 3 Узбекистан, Тянь-Шань, Кураминский хр., Ангренское плато, перевал Чапанкуйды
11 S. parryi leucostictus 3 РФ, Магаданская обл., Хасынский р-н, окр. п. Атка
12 Tamias sibiricus 3 РФ, Приморский край, Партизанский р-н, п. Авангард (биостанция "Восток")
Таблица 2. Характеристика фрагментов, полученных с помощью различных праймеров
Праймер Нуклеотидная последовательность (5'-3') Число фрагментов Фрагмент-маркер, пн Таксон
OPA-02 тоссолосто 29 1093 и 340 Б. ратту1
1000 Б. твlictus
805 Б. йаиткш
OPC-02 аталаасатс 28 800 Б. undulatus, Б. paттyi (ито^вИм)
430 и 230 Б. твlictus
OPC-05 алталссасс 40 800 Б. paттyi
790 Б. и. undulatus, Б. и. jacutвnsis, Б. и. твпгЫвту
440 и 220 Б. dauтicus
247 Б. dauтicus, Б. твlictus (СЫвиш)
OPC-09 стслссатсс 38 1700 и 1230 Б. и. undulatus, Б. и. jacutвnsis, Б. и. твтЫвту
514 Tamias
498 и 230 Б. dauтicus
OPC-10 татстааста 28 440 (м) Б. dauтicus
OPC-12 тотслтсссс 32 600 (м) Б. paттyi
448 (м) Tamias
OPC-16 слслстссло 30 900 и 805 Tamias
830 (м) Б. dauтicus
680 Бpвтmophilus
OPC-20 лсттсосслс 33 1680 и 1550 Б. undulatus, Б. paттyi (ито^вИм)
920 Tamias, Б. и. undulatus, Б. и. jacutвnsis, Б. и. mвnzЪiвтy
670 Б. dauтicus, Б. и. вvвтsmanni
600 Б. dauтicus, Б. твlictus (СЫвиш)
490 Б. dauтicus, Б. paттyi
470 Tamias
465 Б. paттyi
OPD-05 толосоолсл 40 1700 Б. и. undulatus, Б. и. jacutвnsis, Б. и. mвnzЪiвтy
1490 Бpвтmophilus, Б. paттyi (м)
1030 Б. dauтicus (м), Б. твlictus, Б. paттyi
350 Tamias
OPE-20 ллсоотолсс 27 2150 и 1600 (м) Tamias
1700 Б. и. вvвтsmanni (м), Б. твlictus, Б. paттyi
1260 Бpвтmophilus и Tamias, Б. твlictus (м), Б. и. вvвтsmanni (м)
660 Бpвтmophilus и Tamias, Б. и. mвnzЪiвтy (м)
Примечание. м - "мажорность" признака.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
1700—
805 — 514 —
350 пн
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
вл 1700 пн
1700— щ \ m » wm wm wm 1260 пн
805 — J— - —* ш * mm* 2ZZ 1
514 — 660 пн - j- m- — m. mm — 1260 пн 660 пн
Рис. 2. RAPD-спектры Spermophilus dauricus (дорожки 1-3), S. undulatus undulatus (4, 5), S. u. menzbiery (6, 7), S. u. jacutensis (8, 9), S. u. eversmanni (10, 11), S. relictus (12-14), S. parryi (15-17) и Tamias sibiricus (18-20), инициированные праймерами OPD-05 (a) и 0PE-20 (•). M - маркер молекулярногй массы PstI.
лямбда, в качестве негативного контроля - пробу, содержащую полную амплифицированную смесь без добавления ДНК.
Бинарные матрицы составляли по электрофо-реграммам, учитывая все визуально детектируемые полосы: присутствие обозначали "1", отсутствие - "0". Параметры генетической дифференциации популяций рассчитывали с помощью программ POPGENE [16] и TFPGA-ver. 1.3 [17]. Для оценки генетических различий между популяциями и степени их обособленности использовали показатели общего (H), средне-выборочного (Hs) и общего генного разнообразия между выборками (Dst) [18], а также генетической подразделенности популяций (Gst) и числа мигрантов на генерацию (Nm) между локальными популяциями [19]. Кроме того, вычисляли межпопуляционные генетические дистанции D [19] и проводили точный тест на дифференциацию популяций [17]. Фено- (UPGMA) и филогенетические (NJ) деревья реконструировали с помощью TREECON-ver. 1.3 [20]. Дендрограм-му генетического сходства популяций (UPGMA) получили, используя программу TFPGA-ver. 1.3 [17].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Описание RAPD-спектров
RAPD-спектры продуктов амплификации для каждого из десяти исследованных праймеров показали уникальный тип распределения амплифи-цированных фрагментов (табл. 2). Семь прайме-
ров - OPA-02, OPC-02, OPC-05, OPC-09, OPC-20, OPD-05, OPE-20 оказались специфичными к полиморфным последовательностям ДНК. Наилучшую возможность для дискриминации видов сусликов проявили праймеры OPD-05, OPE-20 (рис. 2), а также 0РС-05, OPC-09 и OPC-20. Три праймера -OPC-10, OPС-12, OPC-16 - для всей выборки сусликов синтезировали мономорфные профили, различая при этом выборки Ташгал и ЗрвтшорЫ-¡ыл. К тому же некоторые амплифицированные фрагменты
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.