научная статья по теме МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИЙ РЕДКОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ВИДА ADONIS SIBIRICA PATRIN EX LEDEB. НА ОСНОВАНИИ ПОЛИМОРФИЗМА ISSR МАРКЕРОВ Биология

Текст научной статьи на тему «МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИЙ РЕДКОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ВИДА ADONIS SIBIRICA PATRIN EX LEDEB. НА ОСНОВАНИИ ПОЛИМОРФИЗМА ISSR МАРКЕРОВ»

УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2010, том 130, № 5, с. 481-486

УДК: 582.675.1:575.174.015.3

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИЙ РЕДКОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ВИДА ADONIS SIBIRICA PATRIN EX LEDEB. НА ОСНОВАНИИ ПОЛИМОРФИЗМА ISSR МАРКЕРОВ

© 2010 г. С. В. Боронникова1, З. Г. Кокаева2, Н. Н. Тихомирова1, А. В. Смирнова1,

А. А Бойкова1

1 Пермский государственный университет 2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова E-mail: SVBoronnikova @ yandex.ru

Анализ генетического разнообразия редкого высокодекоративного лекарственного вида Пермского края Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. (сем. Ranunculaceae) проведен методом полимеразной цепной реакции с использованием ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) метода. Выявлено и проанализировано 74 ISSR маркеров. Определены показатели полиморфизма ДНК и уровень генетического разнообразия 4 популяций A. sibirica. Высокие показатели генетической изменчивости установлены в четвертой (P95 = 81.08%; He = 0.2939; ne = 1.5057), а низкие - во второй популяции A. sibirica (P95 = 36.49%; He = 0.1415; ne = 1.2432). Изученные популяции дифференцированы в средней степени, на межпопуляционную изменчивость приходится 20.53% генетического разнообразия. Даны рекомендации по сохранению генофондов редких вдов растений, включая A. sibirica.

Ключевые слова: ISSR маркеры, полиморфизм, генетическое разнообразие, охрана генофондов, редкие лекарственные виды, Adonis.

С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появились новые возможности изучения генетического разнообразия, определения родства на внутри- и межвидовом уровне. Молекулярные маркеры представляют собой полиморфные последовательности ДНК, которые могут быть обнаружены с помощью методов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полиморфизм нуклеотидных последовательностей между отдельными образцами ДНК выявляется по присутствию или отсутствию конкретных полос в спектре фрагментов ДНК при электрофорезе. Отсутствие полосы может быть следствием точечных мутаций, вставок, делеций или инверсий в последовательности ДНК-матрицы [7].

Микросателлитные последовательности окружают многие гены и могут быть использованы как якорные последовательности к этим генам. На этой особенности основан метод ISSR (InterSimple Sequence Repeat), в котором используется один или несколько праймеров длиной в 1524 нуклеотида [10, 27]. ISSR метод не требует предварительного клонирования и секвенирова-ния фрагментов для подбора праймеров и хорошо воспроизводим в строгих условиях реакции.

Этот метод к настоящему времени получил широкое распространение, особенно в исследованиях генофондов различных видов растений [5, 18]. Результаты молекулярного маркирования с использованием ISSR метода успешно применяются и для целей систематики видов растений, в том числе и редких видов из семейства Ranunculaceae [22]. С использованием ISSR маркеров исследован генофонд эндемиков из Китая Monimopetalum chínese Rehd. (Celasteraceae) [25], Rodiola. alsia Rehd. (Frod.) S.H.Fu. (Crassulaceae) [26]. ISSR маркеры использованы также для анализа популяционной структуры эндемика Китая Cupressus chengiana Hu (Cupressaceae) [16]. Эффективным оказалось применение ISSR маркеров для исследования 7 природных и 3 культивируемых популяций лекарственного растения Coptis chinensis L. (Ranunculaceae), распространенного в Китае [23]. ISSR маркеры оказались очень удобными для четкой сортовой идентификации и оценки дифференциации между дикими и культурными популяциями рода Glicine [4], а также для паспортизации сортов Rubus idaeus L. [14]. С использованием ISSR маркеров исследованы генофонды редких видов растений Урала, таких как Digitalis grandiflora Mill. [2], Adonis verna-lis L. [3].

К числу редких видов растений, нуждающихся на Урале в охране, относится Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. - адонис сибирский. Он внесен в региональную сводку с категорией 3 (R) [6]. Вид обладает типично дизъюктивным ареалом. Он растет преимущественно в лесной области по тенистым склонам, около утесов, обрывов, чаще всего на известковой почве. В Пермском крае вид находится на краю ареала распространения и отмечен только в 12 местообитаниях [12]. Этот вид является лекарственным [8] и также, как и Adonis vernalis L., содержит гликозиды сердечного действия, но значительно в меньшем количестве. Ценность лечения сердечными гликозидами заключается в отсутствии накопления ядов в сердечной мышце при длительном применении [12].

Цель нашей работы - провести молекуляр-но-генетический анализ редкого лекарственного вида A. sibirica на популяционном уровне на основании полиморфизма межмикросателлитной ДНК (ISSR метод).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объектов исследований избраны 4 популяции редкого высокодекоративного и лекарственного вида растений A. sibirica из семейства Ranunculaceae: первая популяция (Asi) расположена в смешанном лесу между д. Константиновка и д. Ключи Добрянского района, вторая (As2) - на опушке смешанного леса, на которой находится подъемник горнолыжной трассы около п. Полаз-на Добрянского района, третья (As3) - в мелколиственном лесу учебно-научной базы Пермского государственного университета "Предуралье" Кишертского района, четвертая (As4) - в травянистом сосняке Ильинского района Пермского края. Изученные популяции находятся на расстоянии в 52 км между As2 и As4, 142 км между Asi и As3, 174 км между As3 и As4. Популяции подвергаются антропогенному воздействию сильной (As2), средней (As1 и As3) и слабой (As4) степени [1]. Для анализа молекулярно-генетического полиморфизма ДНК были собраны листья с 30 случайно выбранных растений каждого вида на расстоянии от 30 до 50 м друг от друга. Молеку-лярно-генетический анализ A.sibirica проведен в 2005-2009 гг. Для выделения ДНК использовали методику Торрес и др. [24] с незначительными модификациями. При выделении ДНК брали навески по 100 мг из свежесобранных листьев. Для молекулярно-генетического анализа популяций A. sibirica ДНК выделена из 102 образцов листьев; использованы 15 ISSR праймеров, синтезированных в ЗАО "Синтол" и "Евроген" (Москва).

Реакционная смесь для полимеразной цепной реакции объемом 25 мкл содержала: 2 единицы Taq-полимеразы ("Силекс М"), 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР ("Силекс М"), 25 пМ праймера, 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мМ dNTP и 5 мкл геномной ДНК. Амплификацию ДНК A.sibirica проводили в термоциклере "Терцик" (НПФ "ДНК-Технология", Москва) и MJ MiniCycler (Biorad, USA) для ISSR-анализа по следующей программе: предварительная денатурация 94 °C, 2 мин.; первые пять циклов 94 °С, 20 с; t° отжига, 10 с.; 72 °С, 10 с; в последующих тридцати пяти циклах 94 °С, 5 с.; t° отжига, 5 с; 72 °С, 5 с. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72 °С. Температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров варьировала от 56 до 60 °С. Анализ полиморфизма проведен у 510 проб ДНК A.sibirica. Для проверки достоверности полученных ДНК спектров опыт повторяли не менее двух раз. В качестве отрицательного (К-) контроля в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,5% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 КЬ DNA Ladder) ("ООО-СибЭнзим-М", Москва), определение длин фрагментов проводилось с использованием программы QuantityOne 4.6.2.

Для количественной оценки степени полиморфизма и определения уровня дивергенции между изученными популяциями, полученные данные были представлены в виде матрицы бинарных признаков, в которой наличие или отсутствие в ISSR спектре одинаковых по размеру фрагментов рассматривалось, соответственно, как состояние 1 или 0. При этом учитывали только воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты, полиморфизм по интенсивности не брали в расчет. Компьютерный анализ молекулярно-генети-ческого полиморфизма ДНК проведен с помощью программы PopGen32 и специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel с определением доли полиморфных локусов (при Р95), общего числа аллелей (na), эффективного числа аллелей (ne) [17], ожидаемой гетерозиготности (He) [20]. В качестве показателей оценки генного разнообразия мы использовали следующие параметры: общее генное разнообразие в общей популяции (HT), среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам (HS) и показатель подразделен-ности популяций (GgT) [19,20]. Генетическое расстояние между популяциями определяли по фор-

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ ПОПУЛЯЦИИ РЕДКОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ВИДА 483

муле М. [19, 21]. Статистическая обработка МаЬс а е f ghijMklmnopqrs данных проведена по методике Животовского [9] и Лакина [11].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление полиморфизма длин амплификаци-онных фрагментов ДНК, получаемых в результате ПЦР, проведено с использованием полиморфизма межмикросателлитной ДНК (188Я-метод). Из 20 синтезированных праймеров для изучения

полиморфизма ДНК А.вЛтса отобраны наиболее эффективные 5 праймеров (табл. 1). В четырех изученных популяциях А. вЛшса 188Я-праймеры инициировали синтез 74 фрагментов ДНК, из которых 62 были полиморфными. Доля полиморфных локусов общей популяции (при Р95) составила 83.78%. Размеры фрагментов варьировали от 270 до 1620 пн (табл. 1, рис. 1). Число амплифи-цированных фрагментов ДНК А. вЛшса варьировало в зависимости от праймера от 18 (праймер М1и М12) до 10 (праймер М9). Доля полиморфных локусов в первой популяции А. вЛшса (Ав1) составила Р95=64.86%, в Ав2 - Р95=36.48%, Ав3 -Р95=50.00%, а в Ав4 - Р95 = 81.08%. Этот показатель достоверно отличается при сравнении Ав3 и Ав4, так как и(2.57) > и' (1.96), а также Ав2 и Ав4, так как и(2.25) > и^ (1.9°6). При остальных сочетаниях сравниваемых популяций отличия недостоверны. С помощью праймера М3 выявлены самые низкие значения полиморфизма в популяциях, а праймера Х11 - самые высокие. В среднем при анализе у А^Ътса один праймер инициировал синтез 14,8 фрагментов ДН

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком