ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 12, с. 1634-1640
^ ^^^^^^^^ ГЕНЕТИКА
РАСТЕНИЙ
УДК 575.116.4+576.354.422.4:582.542.1
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ АСИНАПТИЧЕСКИХ ГЕНОВ syl И sy9 РЖИ (Secale eereale L.) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ И ИЗОЗИМНЫХ МАРКЕРОВ
© 2009 г. С. В. Малышев1, Т. В. Долматович1, А. В. Войлоков2, С. П. Соснихина2, Н. В. Цветкова2, А. В. Ловцшс2, Н. А. Картель1
1 Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, Минск 220072;
e-mail: s.malyshev@igc.bas-net.by 2 Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции,
Санкт-Петербург 199034; e-mail: av_voylokov@mail.ru Поступила в редакцию 15.12.2008 г.
Исследования фенотипической экспрессии синаптических мутаций в сочетании с локализацией соответствующих генов на генетической карте позволяют дифференцировать различные этапы мейотического процесса. Два асинаптических гена ржи sy1 и sy9 были картированы в прицентромерных районах длинных плеч хромосом 7R и 2R соответственно, с использованием микросателлитных маркеров (SSR). Ген sy9 косегрегировал с двумя SSR-маркерами Xscm43 и Xgwm132. Другой асинаптический ген sy1 был картирован в интервале между изозимным локусом Aat2 и двумя косегрегирующими локусами Xrems1188 и Xrems1135, которые расположены на расстоянии 0.4 сМ проксимально и 0.1 сМ дистально по отношению к генному локусу. Обсуждаются возможные эволюционные связи картированных генов с гомеоло-гическими локусами видов Triticeae, а также более отдаленных видов злаков, таких как кукуруза и рис.
Эффективность решения такой важной селекционной задачи, как повышение генетического разнообразия сельскохозяйственных культур, напрямую связана с возможностью управления процессом генетической рекомбинации. Главным источником новых генов для улучшения сортов могли бы стать неадаптированные формы и родственные дикие виды, однако широкое их использование часто наталкивается на ряд негативных явлений. Одно из них - проблема "сцепленного груза" (linkage drag), которая заключается в подавлении рекомбинации в районах, сцепленных с селекционно-ценным геном, что приводит к попаданию в создаваемую элитную форму помимо нужного ряда генов нежелательных генов из дикого вида. Причем этот эффект невозможно устранить даже в ходе длительной селекции. Ключом к решению данной проблемы является изучение мейотического процесса [1]. Точный контроль мейоза достигается участием и взаимодействием множества мейоз-специфических генов [2]. Изучение фенотипической экспрессии мейотических мутантных генов ржи и других видов, а также их картирование, в свою очередь, позволяют дифференцировать различные этапы мейоза и выявить первичный эффект мутаций.
Мутанты syl и sy9 ржи являются строго аси-наптическими. В мейоцитах у них обнаруживаются только осевые элементы без каких-либо при-
знаков зрелого синаптонемного комплекса на стадиях, соответствующих нормальной зиготене или пахитене. Анализируемые синаптические мутации характеризуются количественно средним числом унивалентов на материнскую клетку пыльцы (МКП) и распределением МКП по числу унивалентов, учитываемых в метафазе I (MI). Если по первому показателю для мутантов syl и sy9 характерны близкие значения 13.9 и 12.3 унива-лента на МКП, соответственно, то по второму для них характерны существенные различия. У syl 96.8% мейоцитов в MI имеют только унива-ленты, тогда как у sy9 67% клеток имеют только униваленты, а у остающихся 33% клеток наблюдаются немногие биваленты [3, 4].
Исследования мутантов syl и sy9 с помощью метода FISH (флуоресцентной гибридизации in situ) при одновременном использовании субтело-мерных и центромерных проб позволили выявить нарушения на стадии кластеризации субтеломер-ных районов на ядерной мембране - формировании так называемого "букета" хромосом. Так, у мутанта syl вместо одного кластера теломер формируются несколько микрокластеров, а у мутанта sy9 образуется нормальный "букет", однако субтеломерные кластеры диспергируются преждевременно. Предполагается, что мутант syl дефектен уже на раннем этапе образования "букета" [5].
1634
Гены syl и sy9 наследуются независимо и ген sy9 эпистатирует sy1 (sy9 > syl) [6-8]. Также обнаружено слабое (33.3% ± 5.70) сцепление гена syl с изозимным маркером Est6/9, который расположен на 5RL-xромосоме ржи [3, 4].
Как и для большинства основных культур злаков, для ржи созданы детальные молекулярные генетические карты хромосом [9-12]. С их использованием успешно маркированы многие му-тантные и селекционно-ценные гены ржи [1316]. Несмотря на значительный прогресс в молекулярном картировании геномов злаков, лишь немногие мейотические гены размещены на генетических картах пшеницы, кукурузы и риса [2]. В данной работе мы картировали асинаптические гены syl и sy9 ржи с использованием SSR (simple sequence repeat) маркеров.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал и анализ мейоза. Линии, несущие асинаптические мутации syl и sy9, первоначально были выделены из сорнопо-левой ржи Закавказья и сортовой популяции Вятка, соответственно [6, 7], и поддерживаются в виде гетерозиготных инбредных популяций. Гибридные популяции F2, состоящие из 129 и 122 растений соответственно, были получены от скрещивания индивидуальных растений syl/+ и sy9/+ с автофертильной инбредной линией L6 (изолирована из сорта Steel) [17, 18].
Тестирование мейотических фенотипов вели только по цитологическим показателям, для чего колосья каждого растения фиксировали в смеси Ньюкомера и исследовали метафазы I мейоза на давленых препаратах, окрашенных 2%-ным аце-токармином. С этих же растений были взяты листья для изозимного и микросателлитного анализов. На рис. 1 представлена метафаза I у растений с нормальным мейозом (рис. 1,а) и у асинаптических мутантов по генам syl (рис. 1,6) и sy9 (рис. 1,е).
Изозимный анализ. Анализ изозимных локу-сов Sod2 и Aat2 проводили согласно методам, описанным ранее [19]. Грубые экстракты молодых листьев разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим выявлением ферментативной активности.
Микросателлитный анализ. Для картирования мутантных генов была использована выборка микросателлитных маркеров, содержащая геномные SSR-маркеры ржи (Xscm) [20], EST-SSR-маркеры ржи (Xscm, Xrems) [11, 21] и геномные SSR-маркеры пшеницы (Xgwm) [22]. Полимераз-ную цепную реакцию выполняли по методике, описанной Рёдер и др. [22] (маркеры Xscm и Xgwm) или Хлесткиной и др. [11] (Xrems-маркеры). Электрофорез проводили в 6%-ном денатурирующем полиакриламидном геле на автоматическом лазер-
• г- •: •
> Si-
»
>
• ■
s
Щ-
A
л /
с - (
" ч *
ч
>>
ш
ЕР SUT
Рис. 1. Мейоз у нормальных и асинаптических растений ржи. а - метафаза I у растения с нормальным мейозом: видны шесть закрытых бивалентов и один открытый; б - метафаза I у мутанта sy1: все хромосомы в унивалентном состоянии; в - метафаза I у мутанта sy9: видны два открытых бивалента и 10 унивалентов.
ном флуоресцентном секвенаторе ALFexpress II ("Amersham-Pharmacia-Biotech"). Размеры фрагментов вычисляли с использованием программы Fragment Analyser 1.02 (Amersham-Pharmacia-Bio-
a
Размеры аллелей (SSR-мapкepoв) и характеристика расщеплений по синаптическим генам и маркерам в двух картирующих популяциях F2
Локус Размеры аллелей, пн Расщепление Ms : H:L6 x2 P
Ms1 или Ms9 L6
F2-популяция Ms9 х L6
Sod2 - - 23 67 : 30 2.450 0.29
Xscm32 127 124 23 59 : 34 2.121 0.35
Xscm35 190 187 24 60 : 38 3.246 0.20
Xscm31 225 222 24 58 : 38 3.400 0.18
Xrems1130 222 226 21 65 : 34 3.650 0.16
Xscm43 105 113 21 : 62 : 38 4.851 0.09
Xgwm132 121 111 21 : 62 : 38 4.851 0.09
sy9 - - 20 : 100 4.444 0.04*
Xrems1230 285 267 18 : 64 : 38 7.200 0.03*
F2-популяция Ms1 х L6
Xscm92 335 319 35 : 58 : 35 1.125 0.57
Xrems1187 192 195 38 : 58 : 33 1.698 0.43
Aat2 - - 27 : 42 : 27 1.500 0.47
sy1 - - 41 86 3.602 0.06
Xrems1188 145 154 41 : 54 : 34 4.178 0.12
Xrems1135 217 197 41 : 54 : 34 4.178 0.12
Xscm102 144 null 99 : 27 0.857 0.35
* P < 0.05.
tech) путем сравнения с внутренними стандартами известного размера.
Анализ данных. После учета генотипов индивидуальных растений F2 в каждом из исследованных локусов были построены генетические карты сцепления с использованием программы MAP-MAKER/EXP 3.0b [23]. Генетические дистанции в сантиморганидах (сМ) вычисляли с использованием функции Kosambi [24]. Соответствие расщеплений менделевским соотношениям анализировали с помощью критерия %2. Генетические карты изображены с использованием программы MapChart 2.2 [25].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ расщепления по мейотическим генам
Для учета расщепления растения популяций F2 оценивали дважды: по признаку стерильности и цитологически. В популяции Ms1 х L6, расщепляющейся по гену из 127 проанализированных растений 41 было асинаптическим, тогда как у 86 выявлялась нормальная картина мейоза. Полученное соотношение соответствовало менделев-скому 1 : 3 (х2 = 3.602, P = 0.06) и свидетельствует о моногенном наследовании признака.
Для другой популяции F2 Ms9 х L6, которая расщеплялась по гену &у9, из 120 проанализированных растений 20 были асинаптическими, тогда как у 100 выявлялась нормальная картина мейо-за. Полученное соотношение слегка отличалось от менделевского 1 : 3 (%2 = 4.444, P = 0.04). Возможной причиной этого отклонения является наличие в изучаемом участке хромосомы фактора, ведущего к гаметической селекции. Действие такого фактора должно распространяться и на маркеры, сцепленные с мутацией. Подтверждение этого вывода было получено нами при картировании гена &у9.
Маркерный анализ и картирование генов
С целью маркирования асинаптических мутаций ДНК индивидуальных растений F2 популяций Ms1 х L6 и Ms9 х L6 была амплифицирована с набором SSR-мapкepoв различного происхождения, ранее картированных в геноме ржи. Из 40 тестированных sSR-мapкepoв 23 оказались полиморфными хотя бы в одной из двух популяций (67.5%). Среди них 12 маркеров были сцеплены с локусами 8у9 и 8у1 на хромосомах 2R и 7R соответственно. В этих участках хромосом дополнительно были картированы два изозимных л
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.