ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.174.015.3:582.736
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ГОРОХА (Pisum sativum L.) ИЗ КОЛЛЕКЦИИ ВИР НА ОСНОВЕ ДАННЫХ AFLP-АНАЛИЗА
© 2014 г. Е. А. Дьяченко1, Н. Н. Рыжова1, М. А. Вишнякова2, Е. З. Кочиева13
Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва 117312 e-mail: rynatalia@yandex.ru, dyachenko-el@yandex.ru 2Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Санкт-Петербург 190000 3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра биотехнологии, Москва 119234
Поступила в редакцию 06.02.2014 г.
Впервые методом AFLP-маркирования изучена выборка гороха из коллекции ВИР, состоящая из 83 образцов P. sativum, в том числе представителей трех подвидов. Для исследования отобраны преимущественно местные сорта разных направлений использования, оцененные по ряду морфо-биологи-ческих признаков, с учетом максимального эколого-географического разнообразия, включающего центры происхождения вида. Было получено 382 полиморфных AFLP-фрагмента и каждый образец охарактеризован их уникальным набором. Оценено генетическое разнообразие изученного материала и показан широкий диапазон генетических различий исследованных образцов (0.07—0.27). Полученные данные не подтвердили принадлежности образцов к определенным подвидам и не отразили их эколого-географическую дифференциацию. Факторный анализ позволил идентифицировать группы образцов азиатского и европейского происхождения и промежуточный характер большей части образцов изученной выборки.
DOI: 10.7868/S0016675814090045
Горох Pisum sativum L. (сем. Fabaceae) — основная зернобобовая культура нашей страны. Первичными центрами происхождения и разнообразия гороха Н.И. Вавилов считал горные области Передней и Средней Азии и Эфиопию, придавая Средиземноморью статус вторичного центра [1]. Современные исследования несколько скорректировали понимание первичного центра, расширив его странами Передней Азии (Иран, Афганистан, Пакистан и Туркменистан) и всего Средиземноморья (Греция, Италия, Испания и Марокко) [2]. Эфиопию считают вторичным центром разнообразия и происхождения гороха [3, 4].
Большое морфо-биологическое разнообразие и вместе с тем существование континуума морфологических форм затрудняют классификацию рода Pisum L., в особенности определение состава и видовых границ P. sativum [5—7]. Так, например, одни исследователи наряду с P. sativum выделяют виды P. abyssinicum A. Br., P. elatius Bieb. и P. fulvum Sibth. et Smith [7], другие ограничивают объем рода до трех (P. sativum, P. abyssinicum, P. fulvum) [2, 8, 9] или двух видов (P. sativum, P. fulvum) [3, 10]. На основе анализа мирового разнообразия, представленного коллекцией ВИР, морфологических, цитологических данных, а также данных по гибридизации и составу запасных белков предложено в пределах вида P. sativum различать шесть под-
видов: abyssinicum (A. Br.) Berger, asiaticum Go-vorov, elatius (Bieb.) Schmalh., sativum, syriacum (Boiss. et Noe' Berger) и transcaucasicum Makash. [3].
Недавние исследования генетического разнообразия гороха были сфокусированы либо на оценке полиморфизма различных биохимических и молекулярных маркеров [11, 12], либо на анализе отдельных мировых коллекций гороха [13—15]. Однако в этих исследованиях коллекция гороха ВИР, одна из самых крупных в мире (более 7000 образцов), была представлена лишь отдельными выборками. Ранее методом RAPD-марки-рования был изучен полиморфизм 95 сортов восточно-европейской селекции, представленных в коллекции ВИР [16]. Так как сорта представляют только часть коллекции гороха, данные о геномном полиморфизме образцов гороха коллекции ВИР можно считать фрагментарными, и вопрос о том, насколько широко ее генетическое разнообразие, остается неясным. В настоящей работе полиморфизм P. sativum коллекции ВИР впервые исследуется с использованием AFLP — системы мультилокусного молекулярного анализа.
Эффективность AFLP-метода для оценки генетического разнообразия коллекций генбанков, выявления генетической структуры популяций, разделения таксономически сложных видов, под-
видов и разновидностей, определения границ таксонов была показана неоднократно [14, 15, 17, 18].
Таким образом, цель данной работы — молекулярный AFLP-анализ образцов P. sativum из коллекции Генбанка ВИР, охарактеризованных по комплексу морфо-биологических и агрономических признаков и представляющих различные подвиды, местные и современные сорта гороха из всех земледельческих районов мира; исследование взаимосвязи генетического разнообразия образцов с их эколого-географическим происхождением и видовой/подвидовой таксономической принадлежностью.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для работы были отобраны 83 образца культурного гороха P. sativum из коллекции ГНУ ВИР Россельхозакадемии (Санкт-Петербург). В основу подбора материала был положен критерий максимального эколого-географического разнообразия преимущественно образцов различных направлений использования: зерновое (продовольственное), кормовое, овощное. Значительную часть выборки составили образцы из центров происхождения рода Pisum. Все образцы предварительно были охарактеризованы по комплексу морфо-биоло-гических и хозяйственно-ценных признаков [19]. В качестве внешней группы использовали образец дикого вида P. fulvum (таблица).
Тотальную растительную ДНК выделяли с использованием стандартной методики [20]. AFLP-анализ также проводили стандартным методом [21]. Геномную ДНК каждого образца гидролизо-вали рестриктазами EcoRI/TruI. В первом раунде амплификации были использованы стандартные адаптерные праймеры Eco+1 и Tru+1 с одним селективным нуклеотидом на З'-конце. Для второго раунда амплификации были использованы различные сочетания EcoRI/TruI праймеров с тремя селективными нуклеотидами З'-конца каждого праймера. Всего было протестировано 12 комбинаций праймер/фермент.
Продукты амплификации разделяли в 6.5%-ном денатурирующем полиакриламидном геле с использованием системы фрагментного анализа LI-COR 4300 DNA Analyzer (США).
На основании полученных AFLP-спектров были определены значения генетических расстояний, коэффициенты генетического сходства анализируемых образцов и построена дендро-грамма с использованием метода UPGMA [22], а также проведен анализ главных компонент (principal coordinate analysis, PCA). Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ STATISTICA-6.0 (Corporation Microsoft, 1990-1995, США).
Анализ популяционной структуры проводили с помощью алгоритма Байеса в программе STRUCTURE 2.3.1 [23]. Для анализа использовали модель, предполагающую смешение генетического материала (admixture model), а также корреляционные модели, предполагающие наследование аллелей от общего предка путем дрейфа генов. Анализ производился в трехкратной по-вторности для числа субпопуляций к = 2, 3, 4, 5, 6 при количестве повторов 106 и "burn in" — 5 х 105.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для анализа 84 образцов гороха было протестировано 12 AFLP-комбинаций праймер/фер-мент, из которых две пары E-ACA/M-CGA и E-ACA/M-CTG характеризовались высоким уровнем информативности, т.е. позволяли детектировать оптимальное число фрагментов (50— 250) на полиакриламидном геле и выявлять внутривидовой полиморфизм.
В результате AFLP-анализа всего было идентифицировано 405 фрагментов генома гороха. Длины амплифицированных фрагментов варьировали в пределах от 80 до 650 пн. Число доступных для анализа маркеров составило 186 для E-ACA/M-CGA и 219 для E-ACA/M-CTG.
Полученные спектры характеризовались значительным уровнем полиморфизма. Так, из 405 амплифицированных AFLP-фрагментов 382 были полиморфными (94.3%). Процент детектированных полиморфных фрагментов для праймер-ной пары E-ACA/M-CGA составил 96.8, для пары E-ACA/M-CTG — 92.2.
Число уникальных образец-специфичных фрагментов ДНК, выявленных с использованием данных праймерных пар, было высоким и составило 56 фрагментов. В результате проведенного молекулярного маркирования каждый из 84 анализируемых образцов гороха был охарактеризован специфичным спектром AFLP-фрагментов.
На основании полученных AFLP-спектров были оценены уровни генетического разнообразия исследованных образцов гороха. Максимальные генетические различия 0.32 (0.25—0.32) были детектированы между P. sativum и образцом P. fulvum. Уровни внутривидового разнообразия образцов P. sativum варьировали в достаточно широких пределах (0.07—0.27), что, по-видимому, объясняется превалированием местных сортов в исследованном материале. Наибольшее значение межпо-пуляционных генетических расстояний P. sativum ssp. sativum — 0.27 было выявлено для отдаленных по месту произрастания образцов к-40 (Маньчжурия) — к-59 (Чехия). Наименьшее значение генетических расстояний — 0.07 было определено для географически близких образцов азиатского
Образцы Pisum sativum (1—83) из коллекции ВИР, используемые в работе
Подвид,сорт Каталожный номер Происхождение Направление использования Окраска цветка Окраска семени
P. sat. ssp. sativum, M* 1 2006 Дания кормовой с-ф с-б
P. sat. ssp. asiaticum, M* 2 2008 Египет** » » »
P. sat. ssp. abyssinicum, M* 3 1937 Австрия » кр ч
4 2514 Сирия** » г-ф м-б
P. sat. ssp. asiaticum, M* 5 188 Памир** » » с-б
6 1250 » » с-ф »
7 958 Туркестан** » г-ф м-б
8 1251 Таджикистан » с-ф с-б
9 1866 Индия » » »
10 1022 Германия » г-ф м-б
11 2182 Иран** » » »
12 3266 Армения » с-ф с-б
P. sat. ssp. transcaucasi-cum, M* 13 1985 Грузия » » »
14 3980 » » » м-б
15 2174 Болгария зерно-овощной б с-ж
P. sat. ssp. sativum, M* 16 2429 Алжир** кормовой г-ф с-б
17 3429 Египет** » с-ф м-б
18 8093 Мадагаскар овощной б ж-з
19 6468 Судан** зерновой » ж-р
20 7131 Тунис** овощной с-ф с-з
21 7584 Эфиопия** зерно-кормовой » ж-з
22 1836 Африка кормовой » с-б
23 3855 Аргентина зерно-кормовой б с-ж
P. sat. ssp. sativum, Ojo Negro 24 5012 Аргентина зерно-овощной б с-ж
P. sat. ssp. sativum, Long drink 25 8261 Бразилия зерновой б с-ж
P. sat. ssp. sativum, M* 26 8571 Венесуэла зерно-овощной » ж-з
27 693 Канада зерновой » ж-р
28 925 США » » с-з
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.